毛泽东在华北敌后抗战的战略展开大体完成后，很快就把眼光投射到这块重要地区上来。他在中共六届六中全会就提出“巩固华北，发展华中”的任务。他说：“为了策应正面主力军的战斗，为了准备转入新阶段，应把敌后游击战争大体分为两种地区。一种是游击战争充分发展了的地区如华北，主要方针是巩固已经建立了的基础，以准备新阶段中能够战胜敌之残酷进攻，坚持根据地。又一种是游击战争尚未充分发展，或正开始发展的地区，如华中一带，主要方针是迅速地发展游击战争，以免敌人回师时游击战争发展的困难。”他强调：“现在就应该准备这一形势的到来。”会后，周恩来在1939年春来到皖南新四军军部，来帮助他们确定了“向南巩固、向东作战、向北发展”的正确方针。1939年12月，中共中央中原局书记刘少奇到华中敌后，负责指导华中工作。
1940年初，新四军的兵力主要分布在3个地区：叶挺、项英率新四军军部和第3支队驻在皖南；陈毅、粟裕率新四军第1、2支队开辟苏南根据地后成立江南指挥部；张云逸率新四军第4支队开辟皖东根据地后成立江北指挥部。
29日，毛泽东和王稼祥又致电项英、叶挺，强调“你们主要出路在江北，虽已失去良机，但仍非力争江北不可”，并要求他们“须秘密准备多数渡江，为紧急时用”。根据这个要求，新四军江北部队立刻抓紧时机向皖东敌后发展，到3月间就从原来的5000人发展到1.5万人左右，为向苏北发展开辟了道路。
新四军刚取得一点发展，蒋介石立刻命令国民党第3战区司令长官顾祝同，第5战区副司令长官、桂系将领李品仙，第31集团军总司令汤恩伯，苏鲁战区副总司令韩德勤等部向江北新四军进攻。这是国民党顽固派企图在华中发动新的反共高潮的信号。
4月初，蒋介石已打算将军事进攻的重点从江北移到江南。他们分析江南新四军的情况后认为：“叶、项在皖南，如瓮中之鳖，手到擒来；陈、粟在苏南，如海滨之鱼，稍纵即逝”。因此，顾祝同在谈判中多次提出要江北新四军全部南调，以便切断新四军和八路军会合的可能，并使他们集中到苏南狭小地区后再加消灭。
江南的新四军正处于险境之中，这已是十分清楚的事实。4月26日，中央书记处致电项英、陈毅并告刘少奇、张云逸：“皖南军部以速移苏南为宜。”并再次重申一条重要的原则：“在团结抗战时期，我军不应向友党后方行动，而应向战争区域与敌人后方行动。”
局势已日见恶化，而项英的犹豫不决只会使正在恶化的处境更加恶化。5月4日，毛泽东为中共中央起草给东南局及新四军的指示，对项英提出了尖锐的批评。
这个指示到达后，陈毅立刻率部北渡长江，挺进苏北，打破了国民党打算消灭在苏南地区的新四军的图谋。但项英仍固执己见，没有东出苏南同陈毅部会合，丧失了转移的时机，对国民党军队可能发动的突然袭击也仍然不作准备，这就使皖南新四军军部陷入愈来愈危险的境地。
这时，国际形势又发生新的重大变化。1940年6月5日，德国对法国发动全面进攻。5天后，意大利向英、法正式宣战。在德国军队闪电式的进攻下，同月22日，法国贝当政府向德国投降。英军从欧洲大陆退守本土。国际形势的大变动直接影响到中国的抗战。日本企图在英、法无暇东顾之机加紧进攻中国和侵略南洋。7月23日，日本大本营发出：“迅速处理支那事变”的命令。
6月26~27日两天，中共中央召开政治局会议讨论目前时局问题。毛泽东在会上作报告，透辟地分析了法国投降、英国从欧洲大陆撤退后的国际形势及其对中国抗战的影响。他指出：英、法失败将带来两方面影响。一方面，促进德、意、日扩大战争胜利的贪欲；另一方面，又驱使美、英和法国的残余不得不对抗德、意、日。对中国说来，“从英、美、法方面发动的东方慕尼黑危险，已经不存在了，或至少可以说很大地减少了”。“中国投降危险的主要来源，已由英、美、法移至日、德、意，而日本是策动中国投降的最主要的外来力量”。对国内的阶级关系，他一直主张作好两手的准备：既要警惕国民党顽固派发动突然事变，又要力争时局的好转。这时，他对国内时局的好转抱着比前一时期乐观的态度，认为中国目前的抗战形势是：“一方面投降危险空前的增长了，一方面好转的因素亦增长了”，“总的形势是于抗战有利的”。他还指出能够推动时局好转的两个因素是：共产党力量的发展是迫使国民党主体既不能投降又不能“剿共”的最主要的国内因素；国民党党内与党外存在着广大的中间势力，还保存着更多的积极性，这也是使国民党主体既不能投降又不能“剿共”的一个重要原因。这个分析，同他在3月间提出的“发展进步势力，争取中间势力，孤立顽固势力”的思想是前后一贯的，并且把争取中间势力的问题放在更明显的地位。
毛泽东自己也积极从事争取中间势力的工作。6月间，他几次会见到延安访问的南洋华侨领袖、南洋华侨筹赈祖国难民总会主席陈嘉庚等，向他们详细介绍国内抗战情况和两党磨擦问题。当年随陈嘉庚一起到延安的庄明理回忆：“陈先生在延安会见了毛主席，心里十分畅快”。“延安之行以及与中共领导人的会见给陈先生留下很好的印象，从此把战胜日寇，祖国抗战必胜的希望寄托在中国共产党的身上。”
然而，形势的发展表明毛泽东对蒋介石态度的估计还是乐观了一些。蒋介石把国际形势中几大力量相互对峙的局面看作他“解决共产党问题”的大好机会。7月1日至8日，国民党召开五届七中全会。16日，他们提出一个“中央提示案”，要求将陕甘宁边区，改为陕北行政区，归陕西省政府指导；划定八路军、新四军的活动区域限制在冀察两省、鲁西北及晋西北一部，并严令八路军、新四军在一个月内全部开赴上述规定地区。这就使正在进行的国共谈判陷入僵局，中共谈判代表周恩来返回延安。
7月30日和8月1日、4日、7日、8日，中共中央开了五天会，听取并讨论周恩来关于抗日统一战线工作的报告和南方局工作的报告。会议最后一天，毛泽东作了长篇发言，充分肯定周恩来领导下的南方局工作，特别是统一战线工作有了很大发展，注意了中间势力。中间势力是一个中心问题。他强调今后要更加重视国民党统治区域的工作。他说：“过去中央工作方向偏重军事和战区，过去对南方及日本占领区注意很少，今后政治局须用大力加强这方面。中央今后注意力，第一是国民党统治区域；第二是敌后城市；第三是我们的战区。”中共中央把国民党统治区的工作放在全局中如此重要的地位，在以前很长时间内还没有过。为了推动形势向好的方面发展，中共中央决定，周恩来回到重庆继续同国民党谈判，各根据地在加紧对日本侵略军作战的同时也要做好反磨擦的准备。
从8月20日起，八路军在华北的正太铁路沿线同时向日军发起大规模的交通破袭战。这次战役，八路军共出动105个团，20万人，到12月上旬基本结束，史称“百团大战”。八路军前后作战1.8万次，毙伤日军2万余人、伪军5000多人，俘虏日军200多人、伪军1.8万人，八路军伤亡1.7万人。
正当八路军在华北同日军浴血苦战时，蒋介石却加紧在华中部署对新四军的进攻。他认为新四军在苏北的力量比较弱，争夺华中可“先从苏北下手，后打皖南”。9月3日起，国民党江苏省政府主席韩德勤所部分两路大举南下，向已由苏南渡江北上的新四军陈毅、粟裕部进攻。10月4日，韩德勤以多于新四军守军一倍的兵力向黄桥发动总攻。新四军在陈毅、粟裕指挥下，经过4天激战，歼灭韩部主力1.1万人。接着，新四军请曾任江苏省长的苏北著名爱国人士韩国钧到韩德勤处斡旋，却遭到拒绝。韩国钧回来气愤地说：“和平无望！你们还是赶快回去准备自卫吧！”国民党顽固派这次进攻黄桥的惨败完全是他们自己造成的。
黄桥战役后，新四军在苏北敌后站稳了脚跟。
10月19日，国民党方面由何应钦、白崇禧以正副参谋总长名义发出致朱德、彭德怀、叶挺的电报，要求八路军、新四军在收到电报的一个月内全部开到黄河以北，并从已有的50万人缩编为10万人。这封被称作“皓电”的电报，是国民党发动更大规模反共高潮的开端。
10月24日，毛泽东收到周恩来从重庆发来的电报，对形势作出这样的判断：目前国民党方面的种种情况“均证明反共高潮是在着着上升，何白19日电是表示了国方决心”。“如果国际形势更利于英美派，局部‘剿共’会进入全面反共。”
蒋介石为什么要选择这个时候发动新的更大规模的反共高潮呢？这同剧烈变动着的国际形势有关。9月间，德、意、日在柏林签定三国军事同盟条约，英、美也签定协定，两大集团的斗争更加激烈，都想拉蒋介石加入他们的联盟。苏联也正在继续援助国民党政府。这种局面使蒋介石得意忘形。毛泽东认为：“蒋介石现在是待价而沽，一方面准备加入英美同盟，一方面也准备加入德意日同盟。”他判断，无论哪一种局面出现，国共之间的严重斗争都是不可免的。新四军在苏北的胜利，也促使蒋介石更急切地要向皖南的新四军军部采取报复行动。
与此同时，毛泽东对各方面的工作作出周密的部署。他要求苏北的新四军积极整军，细致观察；皖南的新四军“认真准备北移”，于12月底全部开动完毕。他还致电周恩来，要他在重庆加强同苏、英、美等方面的外交人员联络，并“利用时机向国民党各方奔走呼号，痛切陈词，以图挽救”。
尽管如此，蒋介石要消灭新四军的决心已定，各种部署日益加紧。12月8日，何应钦、白崇禧再次电令八路军、新四军全部调往黄河以北。蒋介石又密令顾祝同等暗中做好围歼新四军的准备，还故意把新四军军部北移路线泄露给日本人，以便共同夹击。这个时期内，由于“日汪条约”的签订，毛泽东一度对形势看得比较乐观，认为“此次严重的投降危险已被制止”，并估计“在蒋介石没有真正投降以前，向我大举进攻是不可能的。但是，他并没有因此而抛弃过对蒋介石的警惕，在实际工作中仍要求党内“认真准备对付蒋介石的进攻”。
12月底，国民党顽固派的反共活动不仅没有收敛，反而日见嚣张，已集中了12个师准备进攻华中新四军。12月30日，中共中央召开政治局会议，毛泽东在会上指出：“目前时局还不能说反共高潮已开始下降”。第二天，毛泽东为中央书记处起草指示，除了命令江南部队迅即北移、并从华北派遣一部兵力加强华中外，还要求所有华中及山东的党和军队必须紧急动员起来，为坚持抗日根据地、打破顽固派进攻而奋斗。
毛泽东最担心的是皖南的情况，一再致电项英，催促北移，并在12月26日再次对项英提出了尖锐的批评。
与此同时，毛泽东为新四军军部的安全转移做着最后的努力。12月27日，毛泽东一面请周恩来继续向蒋介石交涉，要他命令李品仙不得妨碍新四军北移；一面以朱德、叶挺的名义急电国民党第五战区司令长官李宗仁和副长官李品仙，恳请他们从抗战的利益出发，不要妨碍新四军的北移。
但是，这时的形势已难以逆转。顾祝同根据蒋介石将皖南新四军“一网打尽，生擒叶项”的命令，已完成围歼皖南新四军的准备，震惊中外的皖南事变终于爆发了。
1941年1月4日，新四军军部及直属部队9000余人遵令北移。由于项英的犹豫不决，行期一再延误，国民党已在新四军行进的必经地区埋下重兵。6日，仓促行动的部队到达泾县茂林地区时，突然受到国民党第33集团军总司令上官云相指挥的7个师8万余人的严密包围和猛烈袭击。双方兵力悬殊，国民党军队又已作了充分准备，新四军陷入苦战中。
7天7夜后，新四军终于因弹尽粮绝而全军覆没。奉命同国民党军队谈判的军长叶挺被扣；项英、袁国平、周子昆等遇难。1月15日，中共中央召开政治局会议，检讨新四军失败的原因，毛泽东指出：从我们自己方面来说，首先是由于项英、袁国平等没有反磨擦的思想准备，其次是指挥上的错误。他提出：袁、项的错误须立即宣布，如何处置交七大解决。会议通过了毛泽东起草的《中央关于项袁错误的决定》。在这次会上毛泽东提出：我们要实行全国的政治反攻，必须要像我们前次反对第一次反共高潮时一样有非常强硬的态度，只有不怕决裂，才能打退国民党的进攻。他又说：左派主张我们马上与国民党大打起来，我们也不能实行这种政策。
1月17日，蒋介石发布取消新四军的命令，把叶挺交付军事法庭审判，将反共高潮推到顶点。国共关系已处于异常紧张的状态。这时，毛泽东反而更加冷静。他接受了刘少奇的建议，提出“在政治上取猛烈攻势，而在军事上暂时还只能取守势”。
1月20日，中共中央召开政治局会议，讨论对付时局的办法。毛泽东指出，要挽救时局，实现好转，必须由国民党当局取消1月17日的命令。会议决定：成立中央军委主席团，由毛泽东、朱德、彭德怀、周恩来、王稼祥组成，军委实际工作由主席团办理。驻国民党统治区的各办事处实行撤退。
当天，根据政治局会议决定，在延安发布了毛泽东为中共中央革命军事委员会起草的重建新四军军部的命令，任命陈毅为新四军代理军长，张云逸为副军长，刘少奇为政治委员，赖传珠为参谋长，邓子恢为政治部主任。随后，新四军军部在苏北盐城成立，整编全军为7个师和7个独立旅，共9万多人，在大江南北坚持敌后抗战。
同时，也根据政治局会议的决定，毛泽东以中共中央革命军事委员会发言人的身分对新华社记者发表关于皖南事变的谈话。他指出：“此次皖南反共事变，酝酿已久。目前的发展，不过是全国性突然事变的开端而已。”“特别是1月17日的命令，包含着严重的政治意义。因为发令者敢于公开发此反革命命令，冒天下之大不韪，必已具有全面破裂和彻底投降的决心。”他说：“目前全国人民的紧急任务，在于以最大的警惕性，注视事变的发展，准备着对付任何黑暗的反动局面，绝对不能粗心大意。”