一、微生物细胞大小的测定
实验目的
（1）学习接目镜测微尺的校正方法。
（2）学习使用显微镜测微尺测定微生物细胞大小。
实验原理
微生物细胞的大小是微生物分类鉴定的重要依据之一。微生物个体微小，必须借助于显微镜才能观察，要测量微生物细胞大小，也必须借助于特殊的测微尺在显微镜下进行测量。
显微镜测微尺由镜台测微尺和目镜测微尺两部分组成。后者可直接用于测量细胞大
小。它是一块圆形玻片，其中央有精确等分刻度，测量时将其放在接目镜中的隔板上。由于目镜测微尺所测量的是微生物细胞经过显微镜放大之后所成像的大小，刻度实际代表的长度随使用的目镜和物镜放大倍数及镜筒的长度而改变，所以，使用前须先用镜台测微尺进行标定，求出某一放大率下，目镜测微尺每一小格所代表的长度，然后用目镜测微尺直接测被测对象的大小。镜台测微尺是一块中央有精确刻度的玻片，刻度的总长为1mm，等分为100小格，每小格长10μm，专用于对目镜测微尺进行标定。
目镜测微尺有两种：一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50或100等分的刻度，使用时直接安装在显微镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5mm的圆玻璃片，其中央刻有50或100等分的刻度，使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。由于不同的显微镜放大倍数不同，即使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数不同而异。也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。因此在使用前须用镜台测微尺校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。
实验材料
（一）菌种
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的染色标本片，啤酒酵母培养24h的PDA斜面培养物。
（二）仪器及其他用品
显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、滴管等。
实验流程
置目镜测微尺→置镜台测微尺→标定测微尺→测菌体大小→记录结果→保养
实验步骤
（一）目镜测微尺的校正
（1）更换目镜镜头 更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。
（2）某一倍率下标定目镜刻度 将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上。先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使两尺左边的某一刻度相重合，向右寻找另外两尺相重叠的刻度。记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。
（3）计算该倍率下目镜刻度
（4）标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度 以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。
（二）菌体大小的测定
（1）在油镜下观察细菌染色标本片，测定其菌体大小。
（2）将啤酒酵母制成水浸片，将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度，即可换算成菌体的长和宽。
（3）求平均值。一般测量微生物细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定10～20个菌体后，求出其平均值即可代表该菌的大小。
实验结果与报告
将各菌大小的测定结果。
思考题
（1）为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微尺每格相对的长度也会改变？能找出这种变化的规律吗？
（2）根据测量结果，为什么同种酵母菌的菌体大小不完全相同？
二、细菌的直接涂片计数法
实验目的
学习直接涂片计数法的原理和方法。
实验原理
直接涂片计数法是将一定数量的样品在载玻片上制成一定面积的涂片，然后在显微镜下直接计数，从而可以推算出定量样品内的含菌量。此法主要适用于鲜乳、稀奶油和发酵剂等的细菌计数。本法操作简便，在短时间内即可得到结果。但不能区分活菌与死菌，计数结果偏高，只适用于菌数较高的样品。若样品菌数低时误差较大。
实验材料
（一）检样
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp。bulgaricus）发酵剂或市售酸牛奶。
（二）试剂与染色剂
革兰氏染色液、1%甲苯胺蓝染色液、2%冰醋酸、9mL无菌生理盐水。
（三）仪器及其他用品
镜台测微尺、划有1cm2方格的载玻片、微量移液器、无菌微量移液器吸头、接种环、香柏油、二甲苯、1mL无菌吸管、无菌试管、显微镜等。
实验流程
稀释样品→涂片→革兰氏染色→油镜观察→计数
实验步骤
（一）测定显微镜视野圆的直径
将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，先用低倍镜找到测微尺并调至视野中部，滴加香柏油后更换油镜。移动推进器，先使镜台测微尺的一条刻度线与左侧视野圆弧相切，再向右计数油镜视野圆的直径占有测微尺刻度的格数，用格数乘以镜台测微尺每格长度0.01mm，即为油镜视野圆的直径。
（二）制备样品稀释液
乳酸菌发酵剂或酸奶中的菌数较高，如果不进行适当稀释，由于视野菌体过密，且涂片不均匀，造成较大误差。用1mL吸管取样品1mL移至9mL无菌生理盐水中，反复吹吸混匀10余次，即为1：10稀释菌液。如果菌体仍较密集，如此重复，制备1：100稀释液。
（三）涂片
用微量移液器取上述稀释菌液10μL（0.01mL）滴加于载玻片的方格内，用接种环均匀涂布于1cm2面积方格内，注意液体不可外流出方格，涂面要薄而均匀。自然干燥后，火焰固定。
（四）染色
用革兰氏染色法染色，乳酸菌的菌体呈蓝紫色，牛乳基质呈红色背景。注意乙醇脱色时间为1min，若脱色不适宜或涂片过厚，可造成菌体与牛乳基质均呈蓝紫色。另一染色方法是用1%甲苯胺蓝染色1min，水洗后用2%冰醋酸脱色1～2s，注意脱色时间不宜过长，否则菌体颜色变浅。水洗后滤纸吸干水分，油镜观察计数。由于牛乳基质对苯胺蓝染色液着色浅，且又经乙酸脱色，所以呈透明无色，乳酸菌或其他菌体则被染成蓝色。
（五）镜检与计数
将染色载玻片置于油镜下观察，计数任意10个视野中的菌数，求出每个视野菌数的平均值X，代入下列公式计算每1mL或每1g样品中的菌数。
实验结果与报告
记录并计算发酵剂或市售酸牛乳中的乳酸菌数量，并对结果进行误差分析。
思考题
如何用显微镜直接涂片计数法测定乳品发酵剂中的乳酸菌数量。
三、酵母菌的血球计数法
实验目的
（1）了解血球计数板的构造和计数原理。
（2）掌握用血球计数板测定微生物细胞总数的方法。
实验原理
血球计数板是一块特别的厚玻片，玻片中央分剖成两个平面，上面各刻有9区，中央一区为计数室，供计数用，此区的长和宽各为1mm。中央平面两侧有小沟，小沟外有两条突起的平台，平台比中央平面高0.1mm，因此计数室体积为0.1mm3，容积为10-4mL。通常计数室分为25个大格，每大格又分为16个小格，每小格容积为4×10-6mL，即1mL菌液容积相当于400万个小格体积。因此只要将细胞悬液注入计数室，计算出一定数量小格的平均菌数，即可算出每1mL的细胞数。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可以采用血球计数板直接计数，一般细菌采用细菌计数板。两种计数板的原理与构造相似，只是细菌计数板较薄，可以用油镜观察；而血球计数板较厚，不能用油镜测定细菌数量，因为计数板下面的细菌难于区分，误差较大。
实验材料
（一）菌种
培养48h的啤酒酵母斜面菌体和菌悬液。
（二）染色液
采用革兰氏染色液（见附录Ⅱ）。
（三）仪器及其他用品
显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、血球计数板、擦镜纸、吸水纸、玻片架、肾形盘、洗瓶、接种环、酒精灯、火柴、滴管。
实验流程
检查计数板→稀释样品→加样→计数→计算→清洗
实验步骤
（一）检查血球计数板
取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时方可使用。
（二）稀释样品
将培养后的酵母培养液振摇混匀，然后做一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4或5个菌体的稀释度为宜。
（三）加样
取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。用滴管取1滴稀释的菌悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。静置5～10min。
（四）镜检
待细胞不动后进行镜检计数。先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。一般应取上下及中央5个中格的总菌数。计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计数格上方（下方）及右方（左方）线上的菌体。每个样品重复3次。
（五）计算
取以上计数的平均值，按下列公式计算出每1mL菌液中的含菌量。
（六）清洗
计数板用毕后先用95%的酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸擦干净。若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶液中进行消毒后再进行清洗。然后放回原位，切勿用硬物洗刷。
实验结果与报告
将结果记录于中，计算每1mL或样品中的酵母菌细胞数，并对结果进行误差分析。
思考题
（1）能否用血球计数板在油镜下进行计数？为什么？
（2）根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？如何减少误差？
四、霉菌的霍华德直接计数法
实验目的
学习霉菌霍华德显微镜直接计数法。
实验原理
霍华德霉菌直接计数法（也称郝氏直接计数法）适用于清汁、浊汁、水、浓缩果汁中霉菌的直接镜检计数。霍华德霉菌计数玻片是特制的玻璃载片，带有一个20mm×15mm的长方形平面，即计测室，其周围有沟，两侧各有一条高出长方形平面0.1mm的突肩，盖片放在突肩上面，盖片和长方形平面之间相距0.1mm。中央长方形平面，突肩和盖片共同形成一个光学工作面。为了便于校正显微镜，计测玻片上刻有两条相距1.382mm的平行线，作为校正显微镜视野的标准线。
实验材料
（一）检样
番茄酱罐头。
（二）仪器及其他用品
烧杯、玻璃棒、折射仪、显微镜、盖玻片、测微器（具有标准刻度的玻璃片）、霍华德霉菌计数玻片。
实验流程
取样→称样→稀释→调节视野→涂片→观察→记录→计算
实验步骤
（一）标准检样的制备
取定量检样，加蒸馏水稀释至折射率为1.344～1.3460（即浓度为7.9%～8.8%）。用糖度计或折光仪测定折射率或浓度，如果折射率过大或过小，须加水或样品，直至配成标准样液，才能进行检验。
（二）显微镜标准视野的校正
将显微镜按放大率为90～125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm，则该视野为标准视野。将载玻片放在载物台上，配片置于目镜的光栏孔上，然后观察。标准视野要具备两个条件：载玻片上相距1.382mm的两条平行线与视野相切；配片（测微器）的大方格四边也与视野相切。如果发现上述两个条件，其中有一条不符合，须经校正后再使用。
（三）涂片
1.检查玻片
首先用擦镜纸或绸布蘸酒精将载玻片和盖玻片擦净。检查是否擦干净，可将盖玻片置于载玻片的两条突肩上观察盖玻片与载玻片突肩的接触处是否产生牛顿环，如果没有产生牛顿环，表明没有擦净，必须重新擦，直至产生牛顿环，方可使用。
2.加样
用滴管或玻棒取一大滴混合均匀的样液，均匀地摊布于载玻片中央的平坦面上，盖上盖玻片（盖玻片可直接盖上去，也可以从突肩边沿处吻合切入）。如果发现样液涂布不均匀、有气泡、样液流入沟内、从盖玻片与突肩处流出、盖玻片与载玻片的突肩处不产生牛顿环等，应弃去不用，重新制作。涂好的制片，在计测室内，每个标准视野的样液体积为：
πr2×0.1=3.1416×（1.382/2）2×0.1=0.15mm3
（四）观察记录
1.观察视野数及分布
对一般样品，每个涂片均检查50个视野（每一个样品至少应测25个视野，才能代表样品的各个部分）。如果检查结果阳性视野低于30%，则检查25个视野即可；如果在30%～40%之间，须检查50个视野；如果在40%～50%之间，须检查100个视野；如果在50%以上或超过更多，则要继续检查，直至检查25个视野的结果与一系列计算结果无差异为止。所检查的50个视野要均匀地分布在计测室上，可用显微镜载物台上带有标尺的推进器来控制，从上到下或从左到右一行行有规律地进行观察。最好同一检样两人进行观察。
2.霉菌菌丝的鉴别
在同一视野内霉菌菌丝的特征是：
（1）霉菌菌丝一般粗细均匀；
（2）霉菌菌丝体内含有颗粒，具有一定的透明度；
（3）有的霉菌菌丝有横隔；
（4）有的霉菌菌丝有分支。
当在标准视野下不能确认为霉菌菌丝时，可放大200倍或400倍上下调节视野，观察不同平面的菌丝。
3.记录结果
阳性视野与阴性视野的判断：在标准视野下，上下调节焦距发现有霉菌菌丝，其长度超过标准视野直径（1.382mm）的1/6（即一个小方格的边长）或三根菌丝总长度超过标准视野直径的1/6，这个视野称为阳性视野，否则称为阴性视野。有时在标准视野中出现极细的菌丝丛或小菌落，则以其直径来计算，超过视野直径1/6为阳性视野，否则为阴性视野。阳性视野用“+”表示；阴性视野用“-”表示。
对初次学习霍德华霉菌计测法者，作记录前，先在记录纸上划出计测室上50视野均匀分布的小格，观察一个标准视野，立即在相应的方格内作“+”或“-”的记录，或“-”以空格表示。
这种记录方法，在计测过程中，可减少重复或遗漏计数的现象，也可以从记录表格上“+”、“-”视野的分布，了解涂片是否均匀。
如果一个样品做两个片子，观察结果误差较大（超过6%），则另取样涂片，观察测定至误差＜6%时为止。
实验结果与报告
（一）计算
霍德华霉菌计测数值，又称霉菌数，用百分比表示。其含义如下：将0.15mm3标准样液，均匀地摊布成厚0.1mm，直径为1.382mm，其面积为1.5mm2的标准视野，在显微镜下检查。按100个视野数计算，其中发现有霉菌菌丝存在的视野数（即阳性视野数）。
（二）注意事项
我国农业部颁标准为阳性视野不超过40%，在国际贸易中，合同上无要求时按部颁标准执行，合同上有要求时按合同执行；每抽取一罐样品制两个片子，每片观察50个视野，如果超过标准指标，应该继续制片，但片子数量不得少于3片即150个视野，如果计测结果相近时，可取其平均值；如对抽样结果有异议，应加倍抽样。全部合格，作为合格处理，其中有一罐不合格，该批作为不合格处理。
（三）报告
做好计测记录，按记录计算计测结果和报告，并对结果进行误差分析。
思考题
霍华德计数法能否用于成熟干酪中霉菌的直接计数？如果能，请设计可行方法检测之。