1931年，日本帝国主义大规模武装侵略我国东北，发动“九一八事变”，并迅速占领了沈阳等地。蔡元培看到，国民党军队不但不抵抗就撤至山海关内，而且其特务、警察机构还加紧镇压主张抗日的民主人士与共产党人，因而更加坚定了与国民党斗争的决心，更加明确地站到爱国、民主、进步的立场上来。他采取与蒋介石截然相反的态度，千方百计保护抗日爱国力量，坚决主张抗战到底。
蔡元培利用各种形式宣传抗日，声讨侵略者，揭露其侵略政策。“九一八事变”后，革命老人何香凝在上海发起“救济国难书画展览会”，蔡元培将自己书写的五副对联赠给展览会展出，为抗日筹集钱财。1933年5月，上海青年会举办“国耻演讲”，他主讲第一讲，题目是《日本对华政策》，从军事、政治、经济、文化等方面，系统地揭露日本侵华的罪恶历史和侵略政策。
第二年，蔡元培从上海到南京，汪精卫请他吃饭。在饭桌上，他语重心长地说：“关于中日的事情，我们应该坚定，应该以大无畏精神抵抗。只要我们抵抗，我们后辈也抵抗，中国一定有出路。”说着，两行热泪便流到了盘子里，和着汤水一起咽下，举座无不感动，汪精卫则感到很不自在。
蔡元培抵抗日本侵略的鲜明立场和坚决态度得到中国共产党人赞扬。1936年9月20日，毛泽东给蔡元培写了一封信，称赞蔡元培的爱国抗日主张，说：“忽见我敬爱之孑民先生，发表了崭然不同于一般新旧顽固党之簇新议论，先生当知：见之而欢跃者，绝不止我一人，绝不止共产党，必为无数量人也！从同志，从朋友，称述先生、同情抗日救国事业、闻之而欢跃者，更绝不止我一人，绝不止共产党，必为全民族之诚实儿女，毫无疑义也。”
1937年7月7日，芦沟桥事变发生，日本侵略者开始全面进攻中国。8月13日，日本侵略军又大举进攻上海。11月2日，上海沦陷，国民政府迁都重庆，中央研究院也不得不随同迁往内地。蔡元培在上海已无法立足，又不愿意跟着国民政府后退，就去了香港。
到香港后，蔡元培的身体因患伤寒病尚未复元，所以非常虚弱。但是，他仍以古稀之年、病老之身，不知辛苦地尽瘁于国事，一刻也没有忘记国难家仇。1938年2月，他在一首诗中抒发抗战必胜的信念：
由来境异便情迁，历史循环溯大原。还我河山旧标语，可能实现在今年。
表明他对战胜日本侵略者的坚定信心。4月，他的老朋友、共产党人吴玉章由欧洲回国，路经香港与蔡元培晤谈时，蔡元培“欣欣然以国共能重新合作，共赴国难，为国家民族之大幸。”5月20日，他在香港公开演讲，希望发挥美术与美育的作用，为抗战作出贡献。第二年，他被国际反侵略大会中国分会推举为第二届名誉主席，又填一首《满江红》词，作为国际反侵略大会中国分会的会歌：
公理昭彰，战胜强权在今日。不必问领土大小，军容赢诎。文化同肩维护任，武装合组抵抗术。将野心军阀尽扫除，齐努力。我中华，泱泱国。爱和平，摧强敌。两年来，博得同情洋溢。独立宁辞经百年，众擎无愧参全责。与友邦共奏凯旋歌，显成绩。
激昂慷慨，表现出抗日救国的坚强意志。