蒋介石虽然在表面上同意迁都武汉，但内心却极不愿意，便极力阻挠在南昌的中央委员赴武汉参加二届三中全会。蒋介石与武汉方面的斗争不仅没有结束，反而更加升级。2月9日，武汉方面召开会议，发表了反对独裁、提高党权、欢迎汪精卫复职等主张，并决定以徐谦等五人在武汉组成行动委员会，作为同蒋介石进行斗争的领导机关。
武汉的军人也积极酝酿反蒋，当时，在武汉的重要将领有唐生智、李宗仁、张发奎、陈铭枢等。张、陈原系第四军第十二、第十师师长，在攻打江西时，均调归第七军军长李宗仁指挥。江西战事基本获胜后，蒋介石将第十师扩编为第十一军，升陈铭枢为军长，戍守武昌。张发奎被升为第四军副军长，仍兼第十二师师长。蒋介石将陈、张两部划入西路军，名义上归西路军总指挥唐生智调遣，实际上是想让其监视、牵制唐部。然而，蒋大搞军事独裁，阻挠迁都武汉，已激起公愤，加上唐生智实力强大，积极争取，陈、张两部大部分将领已基本上与唐站到反蒋势力一边。唐生智和张发奎已公开表示了反蒋的态度，只有第十一军军长兼武汉卫戍司令陈铭枢表示袒蒋。
3月6日，邓演达约唐生智调集军队将第十一军包围，并要挟陈铭枢，如果不赞成他们，“就请滚开去”。陈被迫向唐生智辞职，离开武汉赴南昌向蒋介石报告情况。唐生智自兼武汉卫戍司令，让张发奎兼任第十一军军长。唐还反复做李宗仁的工作，争取他参加反蒋行列。于是，武汉方面的实力人物大都成了蒋介石的政敌。
如果说唐生智与蒋介石的斗争在此之前只是一种单独行动的话，那么，迁都纠纷使这一斗争成了一种联合行动。武汉的国民党左派在与以蒋介石为首的右派的斗争中，需要武汉最大的实力派唐生智做后盾。因为他们虽然调子唱得很高，但一无实力基础，二无群众基础，不过是一类客串的清客，一旦离开了共产党和实力派的支持，将一事无成。而“唐的个人利益迫使他同武汉的领袖们暂时团结起来”。唐积极支持汪精卫回国，指责蒋“不是一个合适的革命领袖”。于是，在武汉形成了反蒋联盟，反蒋斗争日趋激烈。
唐生智在赶跑陈铭枢之后基本上控制了武汉地区，为国民党中央全会的召开提供了一个安宁的环境。3月10日至17日，国民党二届三中全会在武汉举行，因左派占据优势，会议通过了一系列旨在提高党权、抑制蒋介石独裁的决议案。其中，主要的有：《统一党的领导机关案》，确定了国民党内集体领导的制度，废除了中央常务委员会主席职。《军事委员会组织大纲》，规定军事委员会为国民政府的最高军事行政机关，原属总司令的部分重大职权收归军委会，总司令为军委会成员之一，军委会必须有未任军职的三位执行委员参加。《国民革命军总司令条例》，重新规定了总司令的职权。《统一革命势力案》，规定了国民党与共产党及第三国际间的关系，允许中共党员参与国民党的决策与各级政府。此外，会议还追认了武汉临时联席会议的一切决议，并对国民党中央和国民政府的主要机构进行了改选。唐生智被选为军委会主席团成员和国民政府委员。在经过改选后的国民党中央和国民政府中，国民党左派占据优势。国民党二届三中全会成了“不折不扣的反蒋会议”，使大权独揽的蒋介石变成了一个“单纯的受党领导的军事领袖”。在这场斗争中，唐生智是有所收获的。
在宁汉双方你争我斗的同时，北洋奉系军阀加紧南下。直系军阀吴佩孚在湖北遭到毁灭性打击以后，率残部退入河南。1927年2月，奉系军阀张作霖以吴佩孚“武汉不守，祸延长江”为由进兵河南，并扬言“誓收武汉，进取粤、湘”。吴部在奉军强大攻势下，急剧分化，靳云鹗、魏益三等将领宣布归附国民革命军，起兵抗奉。奉军在2、3月间占领了开封、郑州等地，吴佩孚率卫队逃往巩县。
此时，宁汉双方虽然矛盾重重，但并未彻底决裂。3月初，为了对付大举南下的奉军，北伐军进行了军事部署，决定：以唐生智为北路总司令，以唐部第八军为主力，王法勤、魏益三部均归唐调遣，出武胜关，沿平汉路北进；分别以李宗仁、程潜、何应钦为江左、江右、东路总司令，向皖北、皖南、江苏进军。旋因武汉卫戍司令陈铭枢离职，国民党中央执行委员会指派唐生智暂行负责武汉卫戍事宜，而唐又将武昌、汉口卫戍事宜分别交由第四军副军长张发奎、第八军副军长李品仙负责。
为了巩固北伐后方，3月18日，唐生智致电云南将领，规劝他们实行彻底改革，受国民政府节制，勿再拥戴唐继尧。同一天，唐生智还致电国民革命军第十六军军长范石生，催促他积极准备入滇。22日，唐生智向蒋介石报告西路军除令第四、第十一军立即向指定地点集中协同江左军向皖北进军外，并令第八、第三十六军集结柳林、武胜关、孝感一带，相机增援靳云鹗部。应该说，唐生智对北伐是有所准备的。
然而，大敌当前，也未能掩盖宁汉双方的相互倾轧和攻击。蒋介石对二届三中全会前后国民党左派和中共开展的提高党权运动，极为恼火。他不仅没有收敛其反革命活动，反而变本加厉。但是，他又感到要推翻武汉国民政府还缺乏足够的实力，于是，便加紧寻求江浙财阀和帝国主义的支持，公开打出反共的旗号。他还希图在攻下上海、南京后定都南京，展开反武汉的行动。
武汉方面识破了蒋介石的阴谋，“决定不让蒋氏有完全支配上海、南京的机会”，便责成第二、第六两军控制南京地区，并密令江右军总指挥程潜俟机逮捕蒋介石。3月23日，江右军所属第二、第六军的部队首先攻入了南京。但是，蒋介石对倾向武汉方面的程潜很不放心，便向南京周围调集大量军队，迫使程潜部退出南京。持有武汉政府密令的程潜瞻前顾后，未能对蒋氏采取行动，放松了对南京地区的控制。
程潜之所以犹豫不决，是出于以下种种考虑：以湖南人为主的第二、第六军将士因为他们的家属受到湖南农运的威胁，对武汉政府有不满情绪；程潜虽然与武汉实力派人物唐生智同为湖南人，但宿怨极深，互不容纳。程潜一方面对唐生智和武汉政府有所不满，另一方面与蒋介石并无深仇大恨，所以，他不会冒着火中取栗的危险去与蒋介石争夺南京。
为了削减蒋介石的兵权，4月5日，武汉国民政府决定任命蒋为第一集团军总司令，以冯玉祥为第二集团军总司令。而第一集团军下辖四个方面军，唐生智担任第四方面军总指挥，靳云鹗担任前敌总指挥。4月7日，鲍罗廷在其寓所召集中央政治委员会临时紧急会议，决定中央党部及国民政府迁至南京，并命令武汉军事委员会准备“以南京为中心之作战计划”。
可是，蒋介石突然于4月9日进驻南京，并制造了血腥屠杀共产党人和工农群众的“四一〇事件”。在上海，蒋介石封闭了总政治部分部，逮捕政工人员，还发出布告“反对非法的武汉国民党中央党部，要求赶走徐谦、邓演达、唐生智等人”。11日，蒋介石密令“已克复的各省一致实行清党”。第二天，蒋命令全副武装的上海青红帮分子冒充工人，向工人纠察队进攻，又派大批军队以调解“工人内讧”为名，强行收缴工人纠察队的枪枝，并打死打伤工人三百多人，是为“四一二反革命政变”。
继上海大屠杀之后，广东、江苏、浙江、福建、江西、广西、四川等省，也相继进行反共“清党”和屠杀，无数共产党员和革命群众壮烈牺牲。这样一来，国民革命统一战线发生了重大分化，南京成了蒋介石集团反革命的巢穴，武汉方面关于迁都之事搁浅。4月18日，南京国民政府正式成立，宁汉分裂的局面出现了。
蒋介石背叛革命后，以武汉为中心的革命势力掀起了声势浩大的讨蒋运动。汪精卫于4月初回国在上海参加蒋介石的反共会议后又来到武汉，在革命运动继续高涨的形势下，他仍以“左派领袖”的面目出现，被迎任为武汉国民政府主席。一向对蒋不满而支持汪精卫的唐生智在反蒋斗争中表现出极大的热情。4月17日，武汉国民党中央与国民政府下令开除蒋介石党籍，免去其本兼各职，并“着全体将士及革命民众团体拿解中央，按反革命罪条例惩治”。同时，宣布将蒋介石指挥的第一集团军改归军事委员会直辖，任命唐生智为国民革命军总指挥。21日，武汉方面通电否认南京政府，军事委员会号召努力完成北伐及肃清蒋介石等叛党分子。22日，在武汉的国民党中央委员和国民政府委员、军事委员会委员汪精卫、徐谦、唐生智等四十人又联名讨蒋，号召全体党员、革命军人和全国民众积极开展反蒋活动。23日，国民党中央军事政治学校各期学生召集武汉各界在阅马厂举行讨蒋大会，第四、八、十一、十五军及百余团体共四十万人参加。唐生智控制的长沙等地也先后举行了大规模的讨蒋集会。
然而，此时的武汉国民政府已处在新、老军阀和四川、广东等地方军阀的四面包围之中。蒋介石在南京建立国民政府之后，对武汉政权采取了军事包围的态势。他联合粤、桂、川、黔各省军阀，从东、南、西三面向两湖地区进攻：任命四川军阀刘湘、杨森为第五路总指挥和前敌总指挥，令其进攻鄂西。委任黔军周西成、李焱木为第二十五、四十三军军长，由黔东、巴东出兵湘西。派李宗仁、王天培出安庆、九江之间进逼武汉。而北方奉系军阀张作霖为反攻武汉，派张学良、韩麟春沿平汉路南下，集结许昌、郾城一带。
武汉国民政府在遭到新、旧军阀军事包围的同时，在经济上和政治上也面临着严重的危机，蒋介石集团一方面勾结中外反革命势力，对武汉实行经济封锁，使武汉政府内部潜在的经济危机雪上加霜；另一方面，以清党反共为号召，策动武汉政府内部的反共运动，使握有实权的国民党军事将领大都对蒋介石暗送秋波。面对如此严峻形势的武汉政府，真是“山雨欲来风满楼”。唐生智和武汉政府其他重要的人物，都面临着一种选择：要么继续高举革命旗帜，和工农群众站到一起，与新、老军阀和一切反动势力斗争到底；要么脱离工农群众，与蒋介石集团同流合污。在蒋介石的煽动下，武汉政府内部也潜伏着一股反共逆流。
武汉政府名义上控制湖北、湖南、江西三个省。实际上，在这三个省中，湖南、江西的税收分别由唐生智部和北伐军总司令部南昌行营就地征收，没有上缴。因为唐生智不断扩充军队，军需开支日益增大，湖南省政府已是债台高筑，不得不在1927年把1931年的田赋提前征收，湘西一带甚至预征到1932年。广东每月提供的税收，大多被蒋介石截留，成为他拉帮结派、培植嫡系的资本。武汉政府真正的经济来源，只有湖北一省。然而，由于战争一直在进行，军费开支不断在膨胀，筹措军饷成了武汉政府十分紧迫而艰巨的任务。尽管如此，仍是收支悬殊，入不敷出，只好通过增加发行纸币的办法来暂时维持。加上反动势力的经济封锁，武汉政府的经济危机日益加剧。
经济上的困难又带来了政治上的危机，连武汉政府的头面人物如汪精卫、谭延闿等都认为武汉的经济困境是工农群众“过火”的行动造成的，要求限制工农运动。于是，在武汉政府内部出现了一股诋毁农民运动的声势，他们攻击农民运动是“痞子运动”、“惰农运动”，阻碍税收、阻碍北伐，叫嚣“不能为了农民断送北伐”。
唐生智没有随便附和，而是对比过去与现状、主流与细节，进行了冷静的分析与思考。他以北伐的亲身经历，肯定了农民运动的伟大作用。他即将率军进行的第二次北伐仍然需要广大农民的积极支持。唐生智对农民运动的鲜明态度被毛泽东作为典型例子在《湖南农民运动考察报告》中加以引用、宣传。
经济危机也使武汉方面的军队出现了不稳的迹象。由于财政困难、入不敷出，欠饷现象普遍存在，这就为蒋介石集团和土豪劣绅挑起武汉方面军队内部的矛盾找到了突破口。唐生智的部将何键等因为农民运动触及了部分军官或者家属的利益，开始秘密策划反动行动。唐生智虽然并不知晓，但是他还是向他的部将刘兴、李品仙、何键等人打了招呼，强调农民运动与北伐军的命运休戚相关，“革命要先革自己的命”，不能只顾自己，不顾大局；军队要带头稳定下来，下面就是有些冲动，也好解决。何键等了解到唐生智对农民运动的态度后，自然不敢公开对抗，只好在暗地里筹划着他那反革命的行动。
唐生智在武汉政府内外交困、反共反工农浊浪涌来的时候，公开声明支持工农运动，确实是难能可贵的。但是，他没有也无法解决武汉政府在政治、经济等方面所面临的危机。他唯一可行的努力便是尽一个军人的职责，率领千军万马从重重困境中杀出一条血路来。
面对这种四面受敌的危险境地，武汉政府只有主动出击，才有希望打破敌军的围困。但是，武汉政府此时无论从兵力上还是从财力上都不允许在东、北两线同时与蒋介石、张作霖开战。于是，在宁汉对立的新局面下采取何种军事行动，成了一个十分棘手的问题，并产生了东征讨蒋，还是继续北伐抑或采取其他军事行动的争论。
当时，唐生智主张首先东征。他认为蒋介石的力量不大，除第一军外，程潜的第六军、李宗仁的第七军都可以争取过来。如果不及时讨伐，让其坐大，后果将不堪设想，主张乘其基础未固之时，派兵东下，解决长江下游的反动势力。至于奉系军队，虽在向南推进，但有冯玉祥的军队在豫西牵制，谅也不敢长驱直入来攻武汉。周恩来、赵世炎等共产党员联名致电中共中央，指出蒋介石的反革命势力已成为国民革命的主要敌人，呼吁迅速出师讨伐蒋介石。而汪精卫、邓演达等则力主北伐，与冯玉祥会师河南，再联合阎锡山，将奉军赶出京、津地区，然后再来解决东南问题。苏联顾问鲍罗廷及中共的一些领导人如陈独秀、彭述之、张太雷等也倾向于北伐，并指示唐生智部的政治部主任共产党员彭泽湘做唐的工作。“经过几次谈话，唐才同意北伐”。唐生智也认为“只要取得北伐的胜利，要收拾蒋介石也不难”，便把主要精力投入到北伐之中。