在自然界中存在的细菌成千上万，它们常常混杂在一起生活繁殖，细菌的身体又那么小，要想从中找到并分离出我们需要的细菌，犹如大海捞针，难上加难。在科赫之前，从来没有人能够分离得到一种纯的病原菌。找不到病原菌，要诊断和治疗这种病简直是不可能的。
以前；许多科学家都在这个问题上花费了很大的工夫。他们根据不同细菌的口味，为它们配制了可口的饭菜——培养基。所谓培养基，就是人们根据微生物的需要，为其配制的营养，其中含有某种微生物生长、发育及繁殖所必需的各种有机物、无机物和水分等。例如，用牛肉汁再添加一定的成分，就可以作为某种微生物的培养基。培养基实际上有点类似于现在人们用来饲养动物的复合饲料，只不过饲料是用来喂养动物，而培养基是用来培养细菌罢了。
1866年，法国科学家巴斯德设计了一种适宜细菌生长的半合成液体培养基，这是人类为细菌配制的第一个培养基。在此基础上，其他科学家又设计了各种培养基。但所有这些早期的培养基都是液体的，用这样的培养基要获得细菌纯种并进行纯培养是很不容易的。科赫为了找到分离纯化细菌的办法，也做了大量的实验，但是都失败了，科赫为此茶饭不思。
一天，科赫在厨房里无意间发现半生半熟的土豆上长出了一些分散的红色的、白色的小圆点，这是一堆细菌在土豆表面上生长繁殖起来的菌落。他拿起土豆想了想，又放在显微镜下观察，发现红色小点内全是球菌，而白色小点内则全是杆菌。科赫受到了启发，他想：应用固体的培养方法，由于细菌不能像在肉汤里那样可以自由游动，每一个细菌只能在固定的地方生长、繁殖，最后就变成了一小堆细菌，即菌落。根据菌落的特点，不就可以选择分离出所需要的菌种，从而实现纯培养了吗？于是，科赫使用的第一个固体培养基就是切开的熟土豆的表面。
为了防止空气中微生物的感染，他的操作都在一个钟罩下面进行。首先用火焰烧过的小刀斜切开土豆，然后用灭过菌的针尖蘸取少量要培养的混杂的菌类，在土豆切面土轻轻地来回划几下。培养一段时间后，接种的菌类就会向四周蔓延，最后覆盖整个表面。科赫还注意到，如果接种时的实验材料较稀，则会看到在土豆切面的不同部位着生着不同颜色的菌落。可以肯定的是，同一颜色的菌落来自同一个菌种。科赫根据菌落颜色的不同，将同一颜色的菌落取出，再经两次以上同样的培养，最后总能获得纯种。
1881年，科赫正式发表了用土豆分离细菌的技术，引起了科学家们极大的关注。这种在固体培养基上划线分离微生物的方法，就这样由科赫建立起来了，并一直沿用至今，成为微生物学实验技术中最经典同时也是最基本的方法之一。我们今天在实验室里，常常可以看到一个个圆形有盖的小玻璃皿，这就是盛固体培养基的培养皿。
但是，土豆的养分毕竟有限，不可能满足各种菌的口味，它的应用受到很大程度的限制。如何找到一种理想的凝固剂呢？科学家们仍然在思考着、寻找着。
正当科赫为此大伤脑筋的时候，他的一个助手的妻子帮助解决了这个难题。这种让科赫朝思暮想的物质是什么呢？原来就是名不见经传的琼脂。琼脂又叫洋菜，是从石花菜等海藻中提取的物质，历来用作果酱、奶糖等食品的添加剂。琼脂用作培养基凝固剂，简直达到了尽善尽美的地步。首先，琼脂不加热到100℃不会融化，而一旦融化成液体，在温度高于45℃时仍可流动，但低到45℃以下就会凝成固体。利用琼脂这个特点，在实验室里很容易把它与培养基的其他成分在45℃以上混匀，倒入培养皿中制板；而在室温下，它又能凝成固体，这又为我们接种、分离和观察微生物带来了极大的方便。琼脂的第二个特点是它本身含营养成分少，它既不会被细菌分解，也不会抑制细菌生长。由于琼脂的这些特点，使它从被发现开始就成了凝固培养基的理想材料，并一直应用到今天。
分离纯种细菌的难题终于被科赫发明的固体培养法攻克了，但是新的问题又接踵而来。细菌的身体非常小，而且无色透明，用显微镜观察总是看不清楚。为了便于分辨它们，科赫又经过无数次的试验，最后找到了一种好方法。他用一种叫做苯胺的化学物质对细菌进行染色，好比给细菌穿上了漂亮的彩色外衣，放在显微镜下就能看得清清楚楚了。这是科赫对微生物学的又一大贡献——细菌染色法。
科赫一生都致力于细菌学尤其是致病菌的研究，在生物学、医学等领域做了大量开创性的工作。他在分离培养病原微生物的过程中所创立的接种、分离、培养和染色等技术方法，为微生物学奠定了牢固的实验基础，并沿用至今。科赫利用这些技术，分离了许多种致病菌。他在1880年分离出伤寒杆菌；1881年发明了蒸汽杀菌法；1882年成功地分离出了引起可怕的结核病的致病菌——结核杆菌，并论证了它的致病机理；1883年发明了预防炭疽病的接种法；1884年又分离出了霍乱弧菌；1890年，培养出了结核杆菌素，并用来诊断和治疗结核病。由于科赫对科学的卓越贡献，1905年他被授予诺贝尔生理学及医学奖。
科赫攻克了一个又一个科学难题，他一生成就辉煌，建树颇多，这与他深入实际生活、从实践中发现问题是分不开的。科赫生活严谨，思维敏捷，富于探索精神，善于观察问题，喜欢从独特的角度发现别人不容易看到的问题的另一面，并以此为突破口探索问题的本质，最终找到了解决的办法。这些对于我们今天的科学研究仍是很好的启迪。