与此同时，他也开始脱离只是帮父亲抄抄方子的阶段，而进入独立处理病人的阶段。每当他有不够了解或无法解决的难题时，他才去向父亲讨教。每当他自己治好一个病人时，他心中那种宽慰的心情，就更无法形容了。
不过，随着时间的推移，李时珍的兴趣开始发生了变化。小时候因与父亲上山采药，所以对大自然的一草一木，一山一水，一虫一兽，他都感兴趣。但他对治疗病人所用的药物，比对疾病的兴趣更浓一些。
为了满足自己这方面的兴趣和志愿，李时珍开始阅读古代那些专门论述自然界各种事物的书籍，像《山海经》、《尔雅》等，都是他阅读的重点。有些专门论述自然界花草虫兽的书，像《竹谱》、《香谱》、《菊谱》、《兽经》、《龟论》等等，以至于历史书、地方志、小说、炼丹书、药方书、笔记、传记、博物志……他都感兴趣。换句话说，只要他能看到的书，他就要拿来看。他还边看，边摘录，边做笔记和写心得。
就这样，他在家中关门读书达十年之久，据说连大门也不出。他十年内读书多达800种。这个数字现在看来不算太多，但在四五百年前的明代，是一个很了不起的数字。他在27岁那年，还以医术高明，被推荐入朝，在北京当上了太医。这对他自己来说，倒不是什么值得引以为自豪的事，但他自己倒觉得这是读书的好机会。这是因为，在当时那种条件下，有许多宝贵的好书，在民间根本看不到，只有在朝廷的藏书处才能看到。李时珍正是利用这个机会，收集到许多十分宝贵的医药资料的。
李时珍知道，书本上的知识是前人的亲身经历所记载下来的十分宝贵的资料，但他自己也觉得这些资料可能会存在不少不正确、甚至是错误的东西。例如，梁代陶弘景的《本草经集注》“亦多谬误”，唐代的《新修本草》“亦多驳误”，而宋代唐慎微著的《证类本草》也常常“草木不分，虫鱼互混”。他还举出一些例子，如他指出书中把“萎蕤”和“女萎”混为一种药物，其实前者是草本，后者却是藤本植物；而前者是补益性的药，后者却是排浓、消肿的解毒药。更为严重的是把有毒的钩吻误当成能补益身体的黄精。这些都是严重的错误。
李时珍深深知道，医药是人命关天的大事，如稍一不慎，用错了药，那就会是害人而不是救人，这种事是医生所绝对不许可出现的。
神圣的责任感，促使李时珍立下志愿，要重修一本新的本草书，也就是中药学著作。
在李时珍以前，历代的本草学著作，重要的就有四五十种。他为了超过前人，除深入钻研前人的本草书和参考其他各类著作以外，还重视实践，用亲身经历的第一手资料来补充前人的不足，纠正前人的错误，发挥自己的新知。
在广泛阅读前人著作的基础上，他决定到自然界去，做实地调查，亲自实践。他除了在自己家乡各地巡游学习、为人治病以外，还不辞辛苦，跋涉万里，足迹踏遍几乎大半个中国，包括河北、江苏、湖南、安徽、河南等地。通过实地考察，获得了可贵的第一手资料，这就大大增加了写作的科学性。
李时珍就是这样，前后用了近30年的时间，读书、实践、实地考察，最后投入著作。他把自己的著作取名《本草纲目》，全书52卷，190万字左右，书中共收药1892种，其中374种是前人没有提到过，由他新增加入本草书的。书中还绘有药物图1000多幅，治病验方10000多个。
由于书的篇幅过大，刊刻出版困难，直到他去世以后3年才得以出版。
实事求是的科学精神
为了研究每一种药物的效用，使读者能得到正确的知识，并在临床时准确地应用这些药，李时珍除了大量查阅前人已取得的成就并加以利用外，他还对自己认为尚未研究清楚，或还存在疑问的地方，都认真负责地进行调查、研究、分析，最后才得出应有的结论。
为了证实鱼类有发声的功能，他特地到海边向渔夫请教学习，终于获得了这方面的知识：渔人们总是认真倾听水中的声音，如果声音如雷声轰隆隆，这就是石首鱼群来了；如果水中发出轧轧声，那是黄颡鱼群的声音。
为了证实猎人捕蛇的方法，并看看白花蛇身上的花纹的结构，他特地去拜访猎人，并与猎人一同去捕蛇。他看到猎人在石南藤下面铺上沙堆，等白花蛇爬过来盘在沙堆上，便用叉子把蛇捕住。他亲自把蛇翻来覆去地看了一遍，证实这种蛇身上的确有24块方格的花纹。
古代有一本书叫《诗经》，在描写一种细腰蜂的生活时，写下这样的诗句：
“螟蛉有子，蜾蠃负之，教诲尔子，式壳殳似之。”
这首诗说的是一种细腰蜂（蜾蠃），又叫做，自己不会繁殖后代，它总是到螟蛉这种昆虫的窠里，把螟蛉子衔到自己的巢里，并且会念念有词，不久就把螟蛉都变成自己的后代，变成小蜂，用这种方式来繁殖后代的。
这段诗经故事，历代有许多争论：一种意见认为《诗经》所说的就是事实；另一种认为这是错误的，螟蛉不可能变成细腰蜂。在历代本草学家中，也有这两种意见在争论。梁代的陶弘景主张后一种意见，而宋代的苏颂则是前一派的拥护者。做为一个本草学家，如何解决这个争端，证实和判断哪一种意见是对的，李时珍采取认真的态度，亲自到细腰蜂的蜂巢里去解剖，打开蜂巢。他发现：在蜂巢里，有很小的小蜂，它们把螟蛉虫咬住、撕碎，并且把虫子咽下去。原来，它们是在吃虫子，把虫子作为自己的粮食。李时珍说：我“屡破其房”，也就是不止一次地破开蜂房，来证实细腰蜂自身具有繁殖后代的能力，从而否定了《诗经》的说法。而古代把那些自己没有孩子的人，向别人要个孩子抚养的义子，称为“螟蛉子”的说法，当然也是基于错误的认识的。
为了证实铅对人体是有毒的，李时珍曾亲自到铅矿井，与工人一起下井采矿。他还看到采矿工下井以前，总是先吃许多肥肉、狗肉，并喝一些酒，然后才下井去采矿。矿工说：如果空着肚子下井，必然会中铅气的毒，日久就浑身瘫痪，面色发黄，贫血而死亡。李时珍把亲自见到的情况记了下来。
像这样的记载，《本草纲目》多不胜数。过去好多本草学家都没有这样认真负责的精神，所以不是记得不确切，就是缺乏记载。李时珍在这方面大大超过了前代的本草学家。他记载了矿工常发生汞中毒，煤矿工人发生煤气中毒的症状都十分确切，这些在我国是最早的记载。
然而，一部载药1892种的大部头的本草书，一个人是不可能样样都亲自去实践和试验其功效的，更何况其中还有不少是域外、异国的物产，更无法去一一检验。对于这类问题，李时珍只好如实地加以记录，并提出个人的见解和建议。
如有一种药叫麻勃，古书上说凡患疔疮的人忌见到这种麻勃，如见了就会死去。李时珍对此表示怀疑。他说，不知为什么这种病人不能见麻勃，这是“理不可晓”。
古书上记载两种植物，一种叫白龙须，一种叫万缠草。这究竟是些什么东西，李时珍自己根本弄不清，他知道这是古人有时故意给植物起的暗语，所以他说：“二树名皆隐语，无从考证。”他不敢随便乱猜，不懂装懂。
还有一种奇怪的说法，说金刚石是“鹰隼”把沙子吃进肚子后，然后由粪中排出，在河北的沙碛石间变化而成的；还有一种叫“撒八儿”的东西，是玳瑁这种动物遗精在水中，被蛟鱼所吞食，经过多年才结成的……对这些稀奇古怪的东西，多数都是外国传过来的说法，是无法肯定其真假的，李时珍只好说，这些事“无所征询”，但对它也不敢随随便便就加以否定，只好说“理外之事，容或有之”，也未可知，只好留待以后搞博物学的人进一步证实，再加以肯定或否定了。
李时珍这种实事求是的精神，表现出一个自然科学家所应具备的高贵品质，很值得我们大家学习的。他的著作之所以有很高的科学价值，为人们所推崇，这也是其中的一条理由。
为科学而献身的勇气
从事自然科学研究，需要亲身实践，进行科学研究，才能取得第一手资料。在某些学科，亲身的实践有时是需要冒一定的风险的。例如搞化学试验，有时会起火、爆炸等等，没有牺牲精神和勇气，是不可能取得真知灼见的。
对一个本草学家来说，同样存在这样的问题。
李时珍曾经说过，要取得正确的知识，需要亲自实践，绝不能道听途说。例如有一种药叫蛇床，对男人、妇女都有补益作用，而且是比较普通易得之药，但一般群众不愿用它，而随便听人介绍，舍近求远另用它药。李时珍批评这种做法是“贱目贵耳”，就是只相信别人的话，而不相信自己亲眼所见。又如一种叫的植物，历代对它也有很多说法，他引述了历代所说的金莲等不同说法，指出古代之所以这样众说纷纭，没有一定说法，是因为他们“惟据纸上猜度而已”，这种主观的猜度根本要不得，也是解决不了问题的。李时珍解决这种纷争的办法，是亲自去实践，“一一采视，颇得其真”，通过对每一种植物的采集，加以比较，才得到真实的结论。
他对于那种胡乱猜度、道听途说的做法，痛加批判，认为那种做法，不足以效法，“殊无指归”。
有些药物的作用，需要亲身去实践，如他对鲮鲤（即穿山甲），曾经自己做过解剖，以观察它是否真的是以蚂蚁为食，结果发现这种动物胃中果然是充满了蚂蚁。他就是用这种亲眼所见，亲手所做来加以检验的，所以他的著作具有很高的科学性，道理就在这里。
更为可贵的是李时珍还以自己的身体去检验某些药物的药理作用。这是需要有献身科学的精神才能做得到的。
有一种叫罗勒子的药物，据记载可以把眼睛中的异物移去，其功效究竟如何呢？是真是假，李时珍决定做试验。他先用一个碗，碗中放些水，把罗勒子放在碗中，不多一会儿，罗勒子即吸水膨大，形成一层膜，这就说明了它在眼中也能把眼泪吸收起来，这层膜就会吸住异物，所以它确有这种作用。后来他还用自己的眼睛做了试验，效果的确不错。
李时珍的献身精神还不止此。用药试眼，最多眼睛受病。他还曾试验一种药理作用极剧烈的曼陀罗花。曼陀罗花具有麻醉作用，饮用后有如酒醉，可以用来做麻醉药，开刀做手术，都没有问题。古书上曾经说过，曼陀罗花汤喝下去以后，人就会感到像酒醉一样，不由自主地又笑又闹，手舞足蹈。究竟是不是这样，要喝多少才能达到麻醉的程度呢？当时没有现成的经验可循，只有自己亲身试验，才能知道多少药量合适。
麻醉药有一个特点，就是麻醉用量与中毒用量常常相差不多，也许就是一滴之差，多一滴即可使人中毒，而少一滴即有麻醉作用。
李时珍深知，这个试验不能在病人身上试验。病人有病，已经很痛苦，身体也弱，不能再经受折腾，他决心自己亲自饮药试验。
他是知道用药的危险性的，但为了把药量药性搞清楚，“不入虎穴，焉得虎子”，他亲自试验了。药量一点一点地加，他自己也以身体的感受来判断用药量，最后，他终于弄清了这种药的用量，要达到“半酣”，也就是半醉的状态，人就会不自觉地手舞足蹈，欢笑而不自主。
李时珍成功了，他用自己的身体，把这种麻醉药的用量弄清楚了。
伟大的科学成就
李时珍学问渊博，对博物学有深入的研究，其中有许多成就是具有世界水平的。
就《本草纲目》中对药物的分类来说，在当时是具有世界先进水平的。中药的分类最早是汉代《神农本草经》的三品分类法，就是把药物分成补养作用（无毒）、治疗兼补养作用及治疗作用（有毒）三类，叫上、中、下三品。这些方法比较原始，也比较笼统。到梁代的《神农本草经集注》，就改成按药物自然属性把药分成七类，即玉石、草木、虫兽、果、菜、米食、有名未用等，这就比以前进了一步。生物学家发展史表明，分类的情况在一定程度上代表着该学科的水平。经过近千年的进步，李时珍在药物分类学上取得了极大的进展。他把1892种药分成16部62类。就植物而言，他把1195种药分成5部30类，其中包括草部（分山草、芳草、隰草、毒草、蔓草、水草、石草、苔、杂草）、谷部（分麻麦稻、稷粟、菽豆、造酿）、菜部（分荤辛、柔滑、菜、水菜、芝）、果部（分五果，山果、夷果、味果、果、水果）、木部（分香木、乔木、灌木、寓木、苞木、杂木）等。植物的分类法，在《本草纲目》表现出相当高的科学性，例如他已经把桔梗科的沙参、荠、桔梗编排在一起；把伞形科的柴胡、防风、独活排在一起；把姜科的高良姜、豆蔻、白豆蔻、缩砂密、盖智子排在一起；还把菊科的菊、野菊、、蓍、艾、千年艾、茵陈蒿、青蒿、黄花蒿、百蒿排在一起；把蓼科的蓼、水蓼、马蓼、荭草、毛蓼排在一起。这样的排列法，说明李时珍已经对植物的自然分类法有较深入的了解，有较高的科学水平。国际科学史界有人把他的这种科学分类法，与18世纪植物分类学家林奈的分类法，也就是现在通用的拉丁双名分类法相提并论。虽然林奈的分类命名比较科学，但林奈最初的分类，仅仅有12页的《自然系统》，还不如《本草纲目》高明，而且比李时珍晚了140多年。
最值得提出的是，李时珍在动物分类学及遗传学方面的成就。
在《本草纲目》中，李时珍共记载动物药444种，占全部药物的23．4％。他把这些动物药分成虫、鳞、介、禽、兽和人这几部。
为什么要这样分，必然有一个主导思想。李时珍对这个分类法，有他自己的原则，认为这是“由微至巨，从贱至贵”。微与巨，可能是指动物机体体积的大小，从小小昆虫，直至哺乳动物等巨大的兽类。这里的贱与贵最值得注意，它并不是指动物的经济价值的贵贱，也不是人们思想中关于贵与贱的含义。
大家都知道，在封建社会里，龙与凤在人们思想中是至贵的生物，皇帝自比为真龙天子，要穿龙袍，睡龙床；而皇后则比为凤凰，这样才能龙凤匹配。旧小说还认为龙是一种神物，能呵气成云，甚至呼风唤雨。如果是用这个意义上的贵贱而言，则龙、凤应当排列在诸动物的榜首，但实际上《本草纲目》把龙列在鳞类，而比龙应该说低一等的凤，书中把它列为禽类。
再看看猩猩，当时认为猩猩只是一种与鹦鹉相仿，只会学舌的动物。但李时珍却把它列入兽类，而且是兽类中最高的寓怪类。至于人本身呢，李时珍把人列在动物中最高的一级，专立“人”一部。
由此看来，他所说的“贵贱”另有所指，不是指动物的经济价值，也不是指人们思想中所认识的贵贱。那又是指什么呢？
我们具体看一下各类中都有什么动物。虫类都是一些微小的昆虫，鳞则是鱼类，介类中有爬行动物，也有两栖动物；禽类则是指飞禽包括鸡、鸭、鸟等等，兽类几乎都是哺乳动物，最后是万物之灵的人类。
由此看来，李时珍所说的贵与贱，是指动物在智力进化及生物高低方面的贵贱。他排列的这个顺序，与达尔文生物进化论中关于动物进化顺序的排列几乎不谋而合，除了具体到每一种动物，可能有归类不当之处外，从总体上说，李时珍的排列正好符合生物进化的顺序。