《雅典学院》以古希腊哲学家柏拉图所建的雅典学院为背景，以古代7种自由艺术——即语法、修辞、逻辑、数学、几何、音乐、天文为基础，表现了作者对古希腊、罗马的向往以及对真理的追求。
全画以纵深展开的高大建筑拱门为背景，以布拉曼特设计的圣彼得大教堂为范本，两侧的壁龛里，分别供立着智慧女神雅典娜雕像（右侧）和音乐之神阿波罗雕像（左侧），象征着高于一切的理性精神。中心透视点的层层拱门，直通遥远的天际，组成一个极其神圣的环境，并使画面显现出层次感。大厅中，来自不同时代、不同地域和不同学派的著名学者济济一堂。台阶上的人排成一列，其他人被对称而富有节奏地设置于台阶两侧。他们中既有以往的思想家，也有当世的名流，居于中心的是柏拉图（左）与亚里士多德（右）。他们一起向观者走来，似乎还一边激烈地争论着什么。只见柏拉图右手手指向上指天，表示一切均源于神灵的启示。亚里士多德则伸出右手，手掌向下，好像指着他前面的世界，以说明他更看重对现实世界的研究。这两个对立的手势，表达了他们思想上的原则分歧。他们旁边的人或在聆听他们谈话，或在思索着什么。
除了台阶上方柏拉图和亚里士多德这个中心外，在台阶两侧还有另外两个中心，从而共同构成三角形的结构。左方前景的中心是算术、几何、音乐、天文四个学科的创始人毕达哥拉斯，右方前景以几何学家欧几里得为中心。
文艺复兴时期，画家把自己画进作品的画法很流行，拉斐尔也不例外。我们可以看到，图中那个露出半个脑袋、头戴深色圆形软帽的青年，正是拉斐尔本人，他站在正在讨论的波斯先知琐罗亚斯德和地理学家托勒密身边，眼望着观者的方向。
总的来看，整幅壁画具有强烈的纪念碑倾向，人物的性格描绘得非常明确。可以说，它描绘了文艺复兴时代纪念性建筑形象中最典雅的形象，是文艺复兴兴盛期时代精神精粹的表述。