第二次世界大战爆发后，需要大量和多种的杀菌消炎药物，特别是在有脓血存在下仍有杀菌作用的药物，而磺胺类药物在这种情况下是无效的。青霉素在有脓血存在下，仍有杀菌作用，因此它成为深入研究的对象。钱恩从医学研究委员会和洛克菲勒基金会得到资助。在弗洛瑞的指导下，整个病理学院都投入到对青霉素的研究中，使研究的步伐加快了。为了能得到更多的青霉素，他们加大了培养量，并用圆柱形的大瓶子进行培养。然而结果是，青霉素的生成量并没有增加多少。后来，他们发现培养液在1.5cm的深度时，青霉素的生成量最多，培养液太深反而不行，因为青霉菌的生长需要氧气。这样他们就把瓶子横放着来培养，可是瓶子是圆柱形的，横放着要滚动，同时这种圆柱形的瓶子，放1.5cm深的培养液，有效体积太小了，于是又改成扁平的瓶子。最后，他们设计了一种陶瓷的、像医院病人在病床上使用的便盆样子的培养器皿。钱恩等人在研究中发现，可以用极弱的碱性水溶液将青霉素从乙醚溶液中提取出来。这样，就可以用比乙醚液体积小得多的微碱性水溶液把青霉素从乙醚液中提取出来，达到浓缩的目的。他们设计了机械的逆流提取设备，那是一根比较粗的，两端密封的玻璃管，在两端各有两个侧管，让经过滤除青霉菌并酸化后的培养液从玻璃管上端的一个侧管向下流，同时让乙醚自玻璃管下端的一个侧管向上流动，两种液体在玻璃管中混合。因为乙醚的相对密度比水轻许多，所以青霉素被乙醚提取后，便随乙醚液从玻璃管上端的另一侧管流出来。然后还是用这种设备，让微碱性的水溶液从玻璃管上端的一个侧管向下流，同时让提取了青霉素的乙醚液从玻璃管下端的一个侧管向上流。这样青霉素就从乙醚中转移到微碱性的水溶液中。但是，钱恩等人没有办法把极不稳定的青霉素从水溶液中分离出来。后来他试用了1935年瑞典人发明的冷冻干燥法。此法是将水溶液在低温下冷冻结冰，然后在冷冻及高真空下使水在固体状态下升华，溶液中的固体就剩余在容器中。这样他们就把微碱性青霉素水溶液浓缩为棕色粉末。青霉素在非常低的温度下，没有被分解破坏。他们对这种棕色粉末的效价进行测定，1mg棕色粉末相当于5个牛津单位（这是他们自己制定的效价单位。他们把1mL培养液中的青霉素用链球菌做试验，把对它的抑菌能力定为1个牛津单位）。到1940年3月，他们一共得到了100mg棕色粉末，弗洛瑞用这些样品做了药理和毒性试验。他孤注一掷地把这100mg棕色粉末分成两份，注射到两只正常小白鼠体内，没有发现任何反应，说明这棕色粉末没有毒性。1940年5月25日上午11点，弗洛瑞又得到钱恩等人分离出的100mg棕色固体。他用8只小鼠做实验，先在这些小鼠体内注射进致死量的链球菌。1小时后给两只小鼠分别注射10mg棕色粉末，给另两只小鼠分别注射5mg棕色粉末，剩下的4只小鼠不注射棕色粉末，作为对照。注射了5mg的两只小鼠，在10小时内又分别注射了4次5mg的剂量，则一共用去了70mg样品。弗洛瑞的一名助手在实验室守候观察。到夜里，对照组的小鼠全都死了。两天以后，有一只只注射了10mg棕色粉末的小鼠也死了。剩下的3只小鼠都存活了下来，这使他们非常兴奋。这个结果说明含青霉素的棕色固体是有效的，而且证明它就是在体内有效的物质，因为在以前做的实验，都是体外的抑菌试验或是在皮肤表面的试验。于是他们立即着手进行更广泛的生物活性实验工作。同年6月，实验又证明青霉素对葡萄球菌也有很强的杀灭作用，到8月，他们把结果在期刊上发表。10天后弗莱明访问了这个研究组，弗洛瑞感到很失望，因为这是自发表文章以后得到的唯一响应。他去拜访了英国的几家大的制药公司，希望得到他们的支持，可惜的是这些公司都在为支援反希特勒的战争提供前线需要的药品，没有能力再做这种工作。在英国派到法国的远征军从法国撤退以后，希特勒侵犯英国是不可避免的了。弗洛瑞感到，若战争接近牛津，他们的研究结果将全部被毁灭。于是他决定将青霉菌的孢子（孢子是霉菌类、真菌类用于繁殖的物质，霉菌等生长到一定阶段就产生许多孢子，这些孢子又可以发芽生长成菌丝体，就像是农作物的种子一样）涂在当时所有一同工作的人的大衣里面，如果他们之中有任何一个人能够逃脱出去，还可以在别处继续进行研究。1941年1月，他们扩大了制作青霉素的规模，以便积累足够的量来进行临床试验和结构测定工作。他们在制作和提纯青霉素方面也有了突破，使用了一种称为吸附层析法的方法。该方法是把氧化铝装在一根粗一些的玻璃管内，直立放置，然后把青霉素的溶液从玻璃管上端倾入，液体经由氧化铝流下来，青霉素被吸附在氧化铝上，杂质留在流下来的溶液中，然后用合适的溶剂从氧化铝上把吸附的青霉素溶解下来。经过这样精制的青霉素，可以达到50牛津单位/mg。用这种方法精制的青霉素，经兔子试验发现有热源，如果再一次用吸附层析法精制，热源就不存在了。
实验证明青霉素可以被酸破坏，因此不能通过口服给药，因为胃液是强酸性的，所以只能经注射给药。但是如果一次注射大剂量的青霉素，则大部分的青霉素很快经由肾脏从尿中排泄，所以只能是给病人从静脉点滴给药。这就是把青霉素溶于水中放在一个瓶子里，把瓶子倒挂在比病人躺着的位置要高大约1m的高度上，瓶口塞子上扎进一个注射用的针头，针头的一端用橡皮管和另一个注射针头相连，将这个针头扎入病人的静脉中，由一个螺旋夹子调节药品溶液的滴入速度，使用前针头和皮管都需要经过消毒以免相互传染。这样，可使青霉素在较长时间内在人体中维持杀菌的水平，也可采用一天注射多次的办法。1941年2月，他们开始了第一例临床试验，病人是一位警察，感染了链球菌和葡萄球菌，濒临死亡。第一次给他静脉滴注200mg青霉素，然后每3小时再注射100mg，连续5天，病情得到了很大的改善。可是这时，他们制备出的青霉素已经用完，于是他们把从病人尿中回收的青霉素也给病人用了，又持续注射了3天，病人几乎痊愈。病人的良好状态维持了10天，后来因体内残留的细菌引起的肺部感染，导致病人死亡。这是非常遗憾的事，如果他们能够有更多的青霉素，继续给病人注射几天，将体内的细菌全部杀死，病人就可痊愈。这个临床结果，证明青霉素是很有效的抗菌药物。他们吸取了这次的惨痛教训，准备了足够量的青霉素后又开始了3例临床试验。其中1例是一个小孩，这个小孩因脑部严重受伤引起眼后感染。给他用青霉素治疗后眼部感染痊愈，但脑部的严重损伤导致了小孩的死亡。其他两例均为严重感染的病人，经青霉素治疗后都痊愈了。1941年8月，他们发表了临床试验的报告。
英国在反法西斯的战争中已无力发展新药，而弗洛瑞的病理学院是不可能进行青霉素的大规模生产的。于是弗洛瑞和一名助手，在1941年6月到美国去寻求帮助。美国当时尚未参加第二次世界大战。弗洛瑞找到在美国农业部工作的一位朋友求教，他朋友认为，大规模生产青霉素只能像做啤酒一样用深的大罐来培养，像他们用1.5cm深的培养液来培养是不可能进行大规模生产的，因为没有这么大的地方放这些培养器皿。于是他们被介绍到伊利诺州的北方农业研究所去，那里有丰富的深罐培养经验。弗洛瑞的助手留在那里，把他们带去的霉菌孢子用深罐培养。他们在培养基中加入玉米浆（玉米浆是用玉米制淀粉的副产物，呈糖浆状），使青霉素的产量提高了12倍。后来他们发现，严格控制培养过程的pH值对于提高青霉素的产量非常重要。
弗洛瑞在美国医学研究委员会的朋友，为弗洛瑞安排了一次与制药公司会面的会议。弗洛瑞报告了青霉素的研究情况和结果，有两家公司（施贵宝公司和辉瑞公司）愿意参加这项工作。会上达成协议：生产出的青霉素都统一由医学研究委员会安排临床试验，同时决定把青霉素作为一种军事秘密，不公开名称。他们均采用深罐培养法。与此同时，北方农业研究所致力于发现能产生高产量青霉素的霉菌。他们发现了一种长在市场上出售的罗马甜瓜上的绿色青霉菌能产生较高产量的青霉素。美国北方的几所大学也参与了这项工作。威斯康星大学的微生物学家用X光照射青霉菌，以引起它的突变，结果发现，可以在每毫升培养液中含有500单位青霉素的菌种，而弗洛瑞带来的青霉菌只能产生1个单位。后来他们又使突变的菌种产生青霉素的单位提高到900。在美国医学研究委员会安排下，对1942年11月在波士顿一个夜总会的火灾中严重烧伤并已感染的220名病人，进行了临床试验，取得了很好的效果。到1943年前5个月，一共生产了4亿单位青霉素，后7个月又使产量达到200亿单位。到1944年1月，辉瑞公司一个月就生产了1000亿单位，成为世界上生产青霉素最多的制药公司。这时生产的青霉素已经能完全满足战争的需要。
在英国，青霉素的研究也在继续进行，不过他们仍保守地采用表面培养，像培养蘑菇一样，产量很低。后来在英国供应部主持下成立了青霉素化学委员会，英国的几家制药公司参加了这个委员会并参与了青霉素的生产。青霉素化学委员会与美国医学研究委员会，不定期地交流临床试验信息。1943年3月，在牛津进行了大规模的临床试验，共有187位病人；但是因为青霉素的产量低，只能保证17人静脉滴注给药，其余的人只能外用。两种生产方法和研究方法的差别就明显地表现出来。当时虽然英美是同盟国，但资本主义制度使生产的秘密仍不能相互传递。
青霉素的优良杀菌作用和低毒性，使其在第二次世界大战的后期发挥了极其重要的作用。尽管有很多种磺胺类药物可供使用，但青霉素的出现，使磺胺类药物的重要性开始下降。青霉素得以发展成为药用，也是多学科相互配合取得的成果。