1593年2月下旬的一天，威尼斯的天空乌云密布，雷声阵阵，稀疏的雨点打在行人身上，人们匆匆而过，忽然被宗教裁判所监狱来的一队人马惊扰。一位老者自言自语：“他们在押送犯人”。走在这一队人马前面的是几个全副武装的彪形大汉，其后又是几位押解员，他们押解着一个戴着脚链手铐、披枷戴锁的犯人。此人面色苍白，衣冠褴褛，但看上去精神很好、神态自若，他们穿过街巷向海港码头走去。
一艘军舰，停靠在码头上，正等待犯人和押解人员上船。这是专为把布鲁诺从威尼斯送往罗马裁判所而准备的。押送人是伊波罩托·马里阿·贝卡里亚，此人不久就被任命为多米尼克僧团的团长，参加罗马对布鲁诺的审讯。由于土耳其的海盗活动猖獗，所以动用军舰护送以防海上遭劫。
按16世纪基督教会的规定，威尼斯宗教裁判所审完的案子，必须报告罗马宗教裁判所，如果是特别重大的案子，还要把审讯记录和决议的副本送呈罗马。布鲁诺案的审理情况，已报告罗马了，是由罗马教皇使节路多维柯·塔贝欠尔纳送去的。此人十分仇恨布鲁诺。在他的煽动下，罗马的红衣主教维林纳，坚决要求把布鲁诺引渡罗马。于是罗马宗教裁判所于1592年9月下文，要求威尼斯宗教裁判所把布鲁诺引渡罗马。
1593年2月27日，布鲁诺被押解到罗马，囚禁在罗马宗教裁判所的监狱里，从此开始了8年之久的铁窗生涯。
在此期间，宗教权贵们用尽一切威胁利诱手段，企图使布鲁诺屈服，因为他们深知布鲁诺当时闻名全欧洲，是一位影响很大的学者。因此迫使他当众悔罪不失为最好的办法。也就是说，他们不仅要布鲁诺背弃自己为之奋斗的真理，还要利用布鲁诺的声望来维护宗教的威信。但是尽管他们费尽心机，始终没有动摇布鲁诺对真理的坚定信念，在残酷的刑罚面前他毫无畏惧、坚贞不屈，义无反顾地坚持自己的正确观点。他坚信真理必胜。即使在狱中，布鲁诺也没有忘记宣传自己的学说，宣传唯物主义世界观。他无所顾忌地向同牢囚犯讲述关于宇宙无限的学说，抨击宗教神学的无知和愚蠢，高谈阔论地讲他对教会宗教的看法。后来，天主教会对于他终于绝望了。决定对他处以火刑。
布鲁诺被押于罗马监狱期间，宗教法庭对他进行了多次的审讯。对布鲁诺的审讯工作，由最有权威的一批神学家所组成的检查委员会负责，其中耶稣会著名成员罗柏托·贝拉尔米诺是最卖力的一个。他向来以惯于同异端分子周旋而著称，所以让他主持对布鲁诺的审讯。
1593年12月23日，审讯布鲁诺的第一次高级主教会议召开了，这时布鲁诺押到罗马已有大约10个月了。其间罗马宗教裁判所没有审讯过布鲁诺，他们似乎把他遗忘了。在这次主教会议上，按着宗教裁判所法典，每一个囚犯都可以申述自己的要求，并就自己的案子提出辩白。
宗教裁判官问布鲁诺：你需要什么？有何怨诉？
布鲁诺表示：需要衣服和书籍。
红衣主教们决议给他一件随便什么样的外套和一顶帽子，以及一本八开本的圣托马斯的书。后来还给了他一本多米尼克派的祈祷书，又给他笔和纸，叫他写出“交代材料”。教庭则多方收集他的“异端罪证”，企图迫使他屈膝投降。
布鲁诺在押罗马监狱中还受到他在威尼斯时“同牢难友”的叛卖性揭发。其中契列斯蒂诺及格拉齐阿诺等人写出许多揭发布鲁诺的书面材料。因此使布鲁诺的罪名增加了好几条。更出乎布鲁诺意料的是，有人写了一封密告信，从英国经过法国最后传送到罗马宗教裁判官手里，信中指控布鲁诺在伦敦时已被指控为无神论者，并随信附有一本布鲁诺所著的直接抨击教皇和教会的《驱逐趾高气扬的野兽》一书作为罪证。匿名者把书中的“危险”言论一一勾出，并在书的页边上加注了论战性评注。从评注的内容看，此人生活在英国伦敦，比较了解伊丽莎白女王宫廷中的情况，了解布鲁诺在英国的活动，属于伦敦意大利移民的新教公社，是人神学家。他反对布鲁诺，捍卫宗教，特别热烈地维护卡尔文主义。他的告密使布鲁诺的处境更为险恶。
宗教裁判官们拿到《驱逐趾高气扬的野兽》这本书后，随便翻开哪一页，都会从评注中读懂这本著作中那些复杂的比喻和艺术形象。例如，书中“狗”字旁边，评注为圣多米尼克派僧侣；“猴子”旁边注上所有的教士；“鹿”字的旁边注明为廷臣；“蜥蜴”旁边注上改变信仰的阿谀奉承之辈……
这位页边评注者证明，布鲁诺在这本书中不仅表现为天主教会的敌人，而且也反对“神圣信仰的真理”和预定论。并指控说这本书否定祭神仪式，否定敬拜上帝，否定教会关于穷人“有福”的教义。还指控布鲁诺公然亵渎基督。
宗教裁判官们根据这种评论，指控布鲁诺犯有诽谤基督教，诽谤摩西，诽谤福音书上关于基督的故事，反对教皇主义者的偶像崇拜，反对敬拜圣者，嘲笑约拿书中故事，嘲笑关于亚当的传说……把这些指控收进宗教裁判官们编辑的“异端言论”集中。
尽管指控布鲁诺的材料又多了一些，但罗马宗教裁判所长期来，仍只限于重审威尼斯宗教裁判所的审讯的内容。在1594年的一年中，除对每个犯人的例行检查外，没有审讯过布鲁诺。直到1596年的9月18日，才由高级主教会议的神学家们对应在审讯过程中予以驳斥的论点，进行了研讨，便于进一步审讯。
1596年12月16日，宗教裁判所高级主教会议做出决议，决定从布鲁诺的著作中摘出的论点对他进行审讯。1597年3月24日高级主教会议对他进行了审讯，并对他进行规劝，要他放弃那些虚幻的、诸如世界众多之类的见解。
1597年12月23日，宗教裁判所法庭再次审讯布鲁诺，并听取陈述了他的全部要求。
1598年3月16日和12月16日布鲁诺又先后两次受审。在12月16日审讯中给他纸和笔，让他写出报告，迫使他悔罪，否则将对他进一步进行“紧逼的审讯”。这意味着使用各种各样的刑具。不料1598年12月21日，由于山区连降大雨，雨水顺着山坡流进台伯河里，致使台伯河水位不断上涨，开始溢出两岸。在圣诞之夜，河水涨到前所未有的水平，超过了10米，洪水冲进监狱，淹没了牢房，布鲁诺和宗教裁判所的其他囚犯几乎被淹死。罗马城处于一片汪洋之中。这场水灾后。罗马好久未能恢复常态。居民们离开了城市。这座天主教世界的首都顷刻之间变成一座空旷无人的城市。对布鲁诺的审讯也因此搁置下来。
1599年1月8日，教皇克莱门特八世召集红衣主教研究如何处理灾难带来的严重后果。接着不久他向人民宣布：由于上帝发怒而引起了这场灾难，教皇号召人民进行忏悔。其实这场水灾正是教皇西克斯特五世时期在罗马的坎帕尼亚地区滥伐森林造成的后果。
直到1599年1月14日，才再次提审布鲁诺。在这次审讯中作出了关于布鲁诺案的所有决议中最为重要的决议。罗伯特·贝拉尔米诺在教皇克莱门特八世出席的高级主教会议上，宣布关于布鲁诺的“八条异端论点”。1月18日高级主教会议根据指控布鲁诺的八条“异端论点”对布鲁诺进行审讯。
2月4日开庭审讯时，贝拉尔米诺和特派员特拉格辽洛受教皇委派向布鲁诺出示了“异端论点”清单，给他规定40天的悔罪期限。但是，尽管宗教裁判官们用尽一切论据，竭尽一切努力，企图迫使布鲁诺放弃己见。可是布鲁诺却提出了一个使宗教裁判官们感到大为惊愕的庄严声明：决不放弃自己的观点。
两个月后布鲁诺再次被带出监狱，再一次接受全体高级主教会对他进行的审讯。那是一间阴森森的大厅，布置得富丽堂皇。教皇端坐在宝座之上，周围是红衣主教们。还有宗教裁判所的高级官吏、僧侣、戴着兜帽把面孔遮起来的刽子手、武装警卫、罗马贵族和贵宾们。布鲁诺脖子上套着绳索，戴着手铐脚镣，裸露着脊背，从昏暗的牢房里被带到审讯大厅。在审讯中，审判官们费尽口舌，存心刁难，强迫布鲁诺招认那些“异端邪说”，或者抓住他回答的失误，宣布他已“顺从教会”，然后再用忏悔祈祷仪式影响他，并威胁他说拒绝悔罪将导致惨死，用心极其狠毒。然而，布鲁诺经受住了审讯，他坚定不移地再次声明：他不想放弃自己的观点。