李时珍从太医院辞职后，经过一段时间的考察，掌握了大量的资料。这时他就全心致力于《本草纲目》的编写。他动员了全家人，抄写的抄写、整理的整理、归类的归类，李时珍则不断地修改，不断地增添新的内容。
明万历六年（1578），李时珍的伟大著作《本草纲目》脱稿了。这部书从明嘉靖三十一年（1552）起开始动笔到完稿，前后花了二十七年，在这二十七年中，李时珍翻阅了各种书籍800多种，作了三次全面的修改，访问过药农、樵夫、和尚、走方郎中、渔夫，足迹遍及大江南北，真是耗尽了他毕生的精力，这时李时珍已经是六十一岁的高龄了。
《本草纲目》共收药物1892种，比《证类本草》多了300多种。收方1 100多首，其中有许多方子都是他亲自用过的经验药方，还有插图1 100多幅。全书190多万字。它从其庞大的规模、精细的分类方法，缜密的编排体系、丰富的内容为我国医学史增添了光辉灿烂的一章。
《本草纲目》写成后，李时珍的一家和徒弟庞宪自然十分高兴。但是李时珍又为刻书而忧心忡忡，那时距今有四百多年，没有铅字排印，更无现代化的什么照相激光排版，印书都是先刻在木板或竹子上，刻完后在这上面抹上印墨像盖章一样一张张地印出来。且不说这印的功夫，单说把190多万字一个一个地刻出来，还有1 100多幅图，这要多少人力、物力了，那时没有简体字，这图也不能走样，这费劲不费劲？所以李时珍为此发愁。
明万历七年（1579），李时珍奔走于黄州、武昌等地，希望能够找到个刻书的地方。结果未能如愿。第二年又来到南京，仍然让他失望。这时他想起了江苏太仓的王世员。王世员，字元美，自号凤洲，又号广州山人。明嘉靖二十六年（1547）中进士，曾
这王世员是个文人，并不十分通晓医药，但翻开这《本草纲目》的书稿后，竟被吸引住了，他不但觉得这书稿内容丰富，而且文字精彩，他越读越有滋味，只用了三天时间就把《本草纲目》的书稿看了一遍。
待李时珍来取书稿时，王世员大加称赞，李时珍便请他为《本草纲目》写篇序文，王世员欣然答应。王世员是个有才华之人，略加思索便挥笔疾书，不过一刻序文写好，这序文的意思是：读《本草纲目》就像跨进了洛阳的金谷园一样，里面草木繁盛，果实累累，百花争艳，万紫千红；又像进入了东海龙王的宫殿，有着各种奇珍异宝，琳琅满目，光彩夺人；又好像面对那洁白透亮、莹彻无瑕、银光闪闪的一面明镜，将毫毛、头发都照得清清楚楚，书中内容博而不繁，脉络清晰，重点突出，读此书可知世上一切事物，真是一部极有价值的书，希望能够尽快刻印，让世人共睹。
王世员虽然是个声望很高的人，但这时已经罢官在家，书商们又多以经济收入考虑，尽管王世员为《本草纲目》写了序文，仍旧无人愿意刻印。
经过几次奔波，李时珍受到了挫折，但他并不气馁，他坚信这部《本草纲目》一定能够问世。回家以后，他除了看病之外，稍有空暇便拿书稿不断地修改。
有一次，有个病人鼻子流出很稠很臭的黄鼻涕，来找李时珍治疗。这病人对李时珍说：“自从得了这种病之后，一阵阵的头痛，整天头脑昏昏沉沉的，什么也记不住。李时珍对他说：”这是“鼻渊”，又叫“脑漏”，一定要抓紧治疗，否则就不容易治疗了。这“鼻渊”是中医学中的病名，现在一般都称作鼻炎。李时珍开药时用了辛夷、苍耳子、防风、蔓京子之类的药物，并嘱咐病人不要饮酒。
待病人离去后，李时珍又打开书稿，恰恰翻到写着辛夷的那一页。李时珍想起了刚才那个病人，他忽然产生一个问题：“脑漏为什么会造成记忆力减退？”他不断地思索，又想到人在考虑问题的时候常会不自主地用手拍拍脑袋，还有人见到大人打小孩时会说：“别打他的脑袋，打他的屁股吧！打脑袋会使孩子变笨的。”李时珍想着想着，一种逻辑推理后的结论产生了——脑为元神之府！他把这写在《本草纲目》的辛夷药的下面。
“脑为元神之府”是什么意思呢？就是说脑是精神意识产生聚集的地方。也就是说，人的精神意识、思维活动以及记忆功能等是由脑主管的。这在今天看来已经是老幼皆知的事了，可在李时珍的时代人们并不了解。我国现存最早的一部医学理论著作《黄帝内经》中说：“心主神明”，《孟子·告子》篇说：“心之官则思”。这都是把人的精神意识活动、思维功能归之于心。这一观点在李时珍之前没有人提出过异议，人云亦云，一直延续了一千多年，可见李时珍能提出这一见解是多么不容易呀！就像地球绕着太阳转一样，现在是人人皆知，而十六世纪之前，西方的“地心说”一直统治了一千多年，都说是太阳绕着地球转，直到波兰的天文学家哥白尼提出了“日心说”才扭转了人们的观点。
岁月如流，这《本草纲目》的书稿完稿后十年还没有刻印。李时珍已进入古稀之年，他常常手抚书稿，独自悲泣。
明万历十七年（1589），李时珍七十二岁，他决心再去南京，要刻印《本草纲目》。建元见父亲已是年老体弱，不让他再次远行，但李时珍为了实现他的夙愿，坚持要去，最后建元陪同，父子俩人来到南京。这一次，在南京结识了刻书家胡承龙，胡承龙看完《本草纲目》书稿非常赏识，愿意刻印。第二年，《本草纲目》开始制版。
明万历二十一年（1593），《本草纲目》即将刻完付印，但李时珍突然谢世，享年七十六岁。可叹时珍一生心血全在《本草纲目》，结果却未亲自见到此书的出版。
在临终前，李时珍仍念念不忘《本草纲目》，特写了遗表，嘱咐次子建元，将此遗表与《本草纲目》一并上呈朝庭。
明万历二十四年（1596），李时珍去世后三年，建元遵照父亲的遗嘱，在当年十一月将遗表及《本草纲目》一书上呈神宗皇帝，御批曰：“书留览，礼部知道，钦此。”
《本草纲目》于1593年刊行问世以后，社会反响极大。大家都把它视为家中必藏之书，在医药界更是备受欢迎。第一次刻印以后的六十年中，各地书商不断翻刻，前后共达九次，平均不到六年就翻刻一次，还不能满足社会的需求，并于公元1607年传入日本，引起日本各界人士的注意，许多人竞相传抄，而首次传入日本的金陵版《本草纲目》被奉为“神君御前本”。以后陆续被译成日本、朝鲜、拉丁、英、法、德等文字，在国外引起不少学者的重视。有人说这部书“集十六世纪以前药学之大成，对以后药学的研究与发展创造了条件，奠定了基础，起到承前启后，继往开来的作用。数百年来，无不奉为用药之圭臬，临证之津梁”。这一点都不夸张。
达尔文称赞《本草纲目》是“中国古代的百科全书”。他在阐述进化论的观点时，还引用了《本草纲目》中关于金鱼的一段文字，英国的科学史家李约瑟博士把李时珍与西方文艺复兴时代的科学传人伽利略、凡萨利乌斯并列。
李时珍走了，但这颗博物学家的巨星永远在天空中闪烁着它的光芒。在俄罗斯的莫斯科大学，将李时珍的巨幅画像镶嵌在廊壁上。李约瑟博士在他的著作《中国科学技术史》中写道：“……中国博物学家中‘无冕之王’李时珍写的《本草纲目》，至今这部伟大著作依然是研究中国文化中的化学史和其他各门科学史的一个取之不尽的知识源泉。”
原中国科学院院长郭沫若在1956年2月为修建李时珍墓题词：“医中之圣。集中国药学之大成。《本草纲目》乃一八九二种药物说明，广罗博采，曾费三十年之殚精。造福生民，使多少人延年活命！伟哉夫子，将随民族生命永生。”
李时珍永远活在人们心中。