带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽。因为基因表达是在一定调节控制下进行的，外源基因在受体细胞中能表达，必须满足一定的条件，特别是真核基因在细菌中的表达。比如，真核基因表达的启动子能不能被原核细胞RNA聚合酶识别而进行转录？真核基因转录出的mRNA是否具有核糖体结合位点，使翻译能顺利进行？翻译产生的蛋白质能否通过细胞膜而排出细胞？外源蛋白是否会被受体细胞中的蛋白酶降解而失活？总之，基因工程要达到最后目的取得功能蛋白，必须依赖于目的基因的有效转录和mRNA正确的翻译及翻译后加工，如果这些环节中任何一个环节不能正确地进行，均可导致基因工程的失败。
对于上述问题，在基因工程中目前已采取了一些措施，使得某些基因得以正确表达。在转录上，在克隆的目的基因上游接一个原核细胞的启动子，这样原核细胞的启动子作为一种强启动子就可以启动真核基因在原核细胞中表达。在翻译上，大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点是起始密码子（AUG和GUG）和SD序列（一段同核糖体RNA3"末端互补的特异序列），这在真核基因转录产物mRNA上是没有的，为了有效地翻译真核细胞蛋白，现在多应用载体上的核糖体结合位点。此外，目的基因插入的方向必须与载体DNA方向一致，并要保持目的基因的翻译相位不产生错位，保持原有的阅读框架。为了避免目的基因表达产物蛋白质被受体细胞蛋白酶降解，现在一般采用合成融合蛋白的方法。所谓融合蛋白是指它的氨基端是原核细胞序列，羧基端是真核细胞序列。因为在细菌中真核基因表达的融合蛋白比非融合蛋白稳定，不容易被细菌蛋白酶降解。困此，将真核基因引入原核细胞表达时，通常在真核基因的上游接一段原核基因，接一段信号顺序，以便合成产物能分泌到细胞外，另外接一个原核基因表达的启动子，这样，真核基因就便于在原核细胞中表达，合成出所需要的功能蛋白质。
（第三节 ）蛋白质工程
一、蛋白质工程的概念
关于蛋白质工程（protein engineering）的涵义、研究内容及范围，至今尚无定论。由于基因工程的发展，人们从生物化学理论中对核酸和蛋白质的相互关系，知道基因决定了蛋白质的结构。反过来如果搞清了蛋白质的结构以及结构与功能的关系，设计一个新蛋白质，按照这个人为设计的蛋白质结构，去改变基因结构，就能生产新的蛋白质，这就是20世纪80年代初提出来的蛋白质工程的基本涵义，即这是一门从改变基因人手，定做新的蛋白质的技术。另一方面，随着蛋白质（特别是酶）结构功能关系研究的深入，对天然蛋白质结构的改造，特别是功能基因的修饰，可以改变天然蛋白质的理化性质和生物学功能。因此提出了按人们的要求去改造天然蛋白质，甚至从头设计新的蛋白质。将这些研究内容也纳入了蛋白质工程。所以按目前的理解，蛋白质工程至少包括这两方面的研究内容。
简言之，蛋白质工程是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。
二、蛋白质工程的一般技术及其应用
1.蛋白质工程的一般技术
（1）基因定点突变——定做新蛋白质这是根据蛋白质结构研究，设计一个新蛋白质的氨基酸序列，通过修饰编码原蛋白质的DNA序列，最后创造出新的蛋白质的技术。人们长期以来一直希望制造出比天然蛋白质性能更好的新的蛋白质。曾经采用多肽合成的方法从头合成蛋白质，但其局限性很大。虽然有几个成功的例子，但要合成更大的蛋白质是很难实现的，而人工合成的蛋白质并不一定能够折叠成天然蛋白质的构象。因此，受基因工程的启发，解决合成新蛋白质的捷径还得从DNA分子水平人手。根据新设计的蛋白质的氨基酸序列，使DNA在体外发生突变与重组，形成新的基因，然后利用基因工程技术，得到所需的蛋白质，这种对天然存在的结构进行有针对性的突变而产生有活性产物的过程，叫寡核苷酸诱导的定点突变，简称定点突变。可见，蛋白质工程是基因工程与蛋白质结构研究相融合的产物，它是在基因工程的基础上发展起来的，而且仍然需要基因工程的全套技术。
改变基因的核苷酸可以通过不同的方法。
①基因的全化学合成用化学合成方法首先按蛋白质的氨基酸序列，合成几个聚核苷酸片段，这些片段中包括蛋白质的结构基因、转录的起始信号及终止信号，另设计适当的限制酶切位点。另外，根据设计取代几个氨基酸的密码子。然后用连接酶将各片段连接起来。
合成的基因DNA片段末端为黏性末端，以此与质粒连接，转入大肠杆菌或枯草杆菌，最后表达，产生新的蛋白质。这种方法的优点是：a．可以按需要在一个或多个位置上任意改变核苷酸序列，以获得多点突变的蛋白质产物；b．可按需要在核苷酸序列中安排适当的限制酶切点，便于随后进一步的修饰及基因操作。该技术的缺陷是需消耗大量人工合成的寡核苷酸，因此所需费用较高。已用此法合成了人血细胞干扰素、胰岛素、生长激素释放抑制激素（GRIH）、脱乙酰基胸腺素等蛋白质基因。
②基因直接修饰法将连接于质粒上的某蛋白基因，用酶法除去DNA的一条链或一小段，用合成的并含选择性取代碱基的寡核苷酸与蛋白基因位点杂交；然后用DNA聚合酶和连接酶修复第二条DNA链以及含有突变的蛋白质基因；最后用常规方法分离出含有突变蛋白基因的质粒，通过转化、表达产生新蛋白质。这种方法避免了化学合成方法需大量消耗合成寡核苷酸的缺点，但要求找到一种适宜的限制酶，其切点刚好位于被修饰的核苷酸上。用此法已做过β-内酰胺酶、酪氨酰-tRNA合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白基因。
另外，还有盒式突变技术。
（2）蛋白质设计——对天然蛋白质的修饰广义而言，像建筑学家们根据建筑力学的理论基础，可随意设计建造千姿百态的高楼大厦一样，生物化学和分子生物学家也可以按照蛋白质结构功能的理论基础，随意设计出各种各样的、比天然蛋白质性能优越得多的新型蛋白质。显然，这种设计强烈地依赖于对蛋白质的一级结构、空间构象以及结构与功能关系的清楚了解。然而，直到现在从生物化学发展的水平来看，对这些知识的了解仍然是支离破碎的，缺乏系统的理论，所以今天的蛋白质设计仅仅是天然蛋白质的修饰。
蛋白质设计完全依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立。蛋白质结构测定的基本工具至今仍然是以X射线晶体衍射技术为主。分子模型的建立采用电脑设计、建立，在屏幕上可以清楚地显示蛋白质的骨架以及在特定环境下的表面结构。能够从分子的内部或外部观察蛋白质分子的某一段面的结构，而且可以用透视方法，从不同角度观察其立体形象和彩色图。在屏幕上组建的模型易于组装、操作、储存及修改。电脑设计的分子模型已成为蛋白质设计的有力工具。
蛋白质设计一般具有下列步骤：
①选定欲研究的某一功能蛋白质后，为了获得较大量的该天然蛋白质，首先应用基因工程技术使编码该蛋白质的基因克隆并表达，测定该蛋白质的性质，并估计其应用价值；②测定该蛋白质的结构，从蛋白质的三维结构出发，应用结构与其功能的相关知识选择适当的修饰位点，在电脑屏幕上设计出第二代蛋白质模型；③利用蛋白质工程技术按照设计蓝图生产出新一代的蛋白质；④研究第二代蛋白质的三维结构，为第三代蛋白质的设计提供信息指导，上一次设计中未能预见到的细微结构改变，可以在这次设计中考虑进去，如此反复进行，直至得到满意的新型蛋白质。
蛋白质设计包括对蛋白质的活性设计、专一性设计、框架设计等方面。在当前的水平下，人工设计的蛋白质分子的框架不一定要像天然蛋白质框架那样复杂，因为天然蛋白质除了它本身的基本功能外，还涉及其他方面的功能，如别构作用、信息传递、分泌等。所以框架设计不一定需要那么完美，不需要太严谨，结构太固定反而会妨碍行使功能，而且由于底物的结合，常常还会引起框架的改变。
现在，在蛋白质工程中对部分蛋白质的一级结构及空间构象进行了部分改造，如通过氨基酸的取代、缺失或插入对一级结构进行改造，包括去羧基端胰岛素、异常血红蛋白的氨基酸取代、高甜度蛋白甜味剂（如罗汉果甜味蛋白）的改造等。在构象的改造方面，已进行过胰岛素晶体结构改造，使之易于聚集。对羧肽酶B及胰凝乳蛋白酶的构象改造，提高了酶活性。
2.蛋白质工程的应用
目前蛋白质工程主要用于酶学研究，改造和修饰酶，其次是用于改造和研制新药。
（1）蛋白质工程酶——酶特性的改造对酶的活性中心的必需基团进行置换、增加或删减，从而改变酶的活性。如酪氨酰-tRNA合成酶，若将其第51位的苏氨酸被脯氨酸取代，酶的催化活力提高25倍，对ATP的亲和性提高100倍；枯草杆菌蛋白酶第222位的甲硫氨酸为半胱氨酸取代后，其活性也有所提高。
利用蛋白质工程还可以改变酶的底物的专一性，提高酶的稳定性，产生新酶。
（2）合理药物设计——蛋白质工程用于新药研制蛋白质工程在药物设计上，在改变药物特性、研制高效、低毒新药等方面也已成为重要的手段。例如，抗病毒药β-干扰素的稳定性较差，通过蛋白质工程，将β-干扰素17位的半胱氨酸用其他氨基酸（如丙氨酸或苯丙氨酸）取代，就再不能形成二聚体，就可以保持β-干扰素的活性不易改变。
蛋白质设计在新药研制中也已得到很好应用。例如，对一种治疗艾滋病的药物设计即是一例。艾滋病主要由获得性免疫缺损病毒HIV引起，HIV的基因产物HIV-1蛋白水解酶是一种重要毒素，美国Abbott公司的一个研究小组设计了HIV-1蛋白水解酶抑制剂，是一种多肽，能与HIV-1蛋白水解酶结合，并通过对该酶抑制剂构象的进一步研究和修饰，使其活力大大提高，对HIV-1蛋白水解酶的选择性结合比其他相关的酶要高10000倍。
尽管蛋白质工程的发展历史很短，但由于它在理论上对生命科学发展的贡献，使得人们可以按照自己的意愿定向地改造蛋白质和酶，以及由此在商业上可能带来的巨大价值，因而它的发展方兴未艾、迅猛异常，蛋白质工程必然有着无限广阔的发展前景。