三级结构是蛋白质分子在二级结构的基础上进一步盘曲折叠形成的三维结构，是多肽链在空间的整体排布（图2—6）。在蛋白质三级结构中，多肽链上相互邻近的二级结构紧密联系形成一个或数个发挥生物学功能的特定区域，称之为结构域，这种结构域是酶的活性部位或是受体与配体结合的部位，大多呈裂缝状、口袋状或洞穴状。
三级结构主要靠多肽链侧链上各种功能基团之间相互作用所形成的次级键来维系的，其中有氢键、离子键、疏水键和范德华力等，其中起主要作用的是疏水作用力。
4.蛋白质的四级结构
蛋白质的四级结构是指由两个或两个以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互作用形成的三维空间结构，其中每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基。蛋白质的四级结构涉及亚基的种类和数目以及亚基在整个分子中的立体排布、亚基问相互作用和接触部位的布局，但不包括亚基内部的空间结构。亚基单独存在时一般没有生物活性，只有形成四级结构才具有完整的生物活性。
维系蛋白质四级结构的化学键主要是疏水作用力，此外，氢键、离子键及范德华力也参与四级结构的形成。
蛋白质中亚基可以相同，也可以不同。如血红蛋白是由4个亚基组成，其中两条α链、两条β链，α链含有141个氨基酸残基，β链含有146个氨基酸残基。每条肽链都卷曲成球状，都有一个空穴容纳1个血红素，4个亚基通过侧链间次级键两两交叉紧密相嵌形成一个具有四级结构的球状血红蛋白分子（图2—7）。
血红蛋白四级结构示意
三、蛋白质结构和功能的关系
不同蛋白质分子中氨基酸的种类和数量不同，以及排列的顺序、空间结构不同，这就使得蛋白质的种类非常繁多并具有多种多样的功能及许多特殊的性质。研究蛋白质的空间构象和生物功能的关系，已成为当前分子生物学的一个重要方面。但是蛋白质的空间构象归根到底还是决定于其一级结构和周围环境的影响，因此研究一级结构和功能的关系是十分重要的。
1.蛋白质分子一级结构和功能的关系
蛋白质一级结构是空间结构的基础，各种蛋白质因其氨基酸的种类、数量和排列顺序的不同，形成的空间结构则不同。空问结构是蛋白质生物学功能表现所必需的，因此蛋白质的一级结构也与其功能密切相关。如神经垂体释放的催产素和抗利尿激素都是九肽，其中只有两个氨基酸不同，而其余七个氨基酸残基是相同的，但二者生理功能却有根本的区别。催产素能刺激平滑肌引起子宫收缩，表现为催产功能；抗利尿素能促进血管收缩，升高血压及促进肾小管对水分的吸收，表现为抗利尿作用。
不同结构的蛋白质具有不同的功能。任何不同功能的蛋白质，彼此之间的结构是完全不日或不完全相同的，即各种蛋白质的特定功能是由其特殊的结构所决定的。在生理功能方目，胃蛋白酶之所以不同于胰蛋白酶，血红蛋白不同于肌红蛋白，胰岛素不同于生长激素等，都是以其特定结构为基础的。
蛋白质一级结构的改变，导致功能的改变。如血红蛋白的口链上含有146个氨基酸，由于遗传物质（DNA）的突变，使其β链第6位谷氨酸被缬氨酸所代替，血红蛋白的一级结构因这一细微的变异，引起一种遗传性疾病——镰刀形红细胞贫血症。在美国黑人中这种发病率高达10％，这种由于蛋白质一级结构中个别氨基酸的改变，而导致的机体疾病，称为分子病。
研究蛋白质一级结构和功能的关系，主要研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。许多研究结果表明，一级结构中，有的部位即不能缺失，也不能更换，否则就会丧失活性；有的部位则可以改变，切除或更换别的残基均不能影响生物的活性；还有的部位必须切除之后，蛋白质分子才显活性。不同部位的残基对功能的影响，实质是影响了蛋白质分子特定的空间构象的形成。
2.蛋白质分子构象与功能的关系
蛋白质空间结构与生物学功能是统一的、对应的关系，只有蛋白质具备了特定的空间结构，它才具有相应的生物学功能，空间结构的变化必然会导致功能的改变。
蛋白质的生物学功能与它的空间结构密切相关的更典型例子是蛋白质或酶分子的变构效应或变构调节。如血红蛋白是两个α亚基和两个β亚基组合而成的四聚体，具有稳定的高级结构，每个亚基含有一个亚铁血红素辅基，辅基中的铁Fe2＋能与O2结合，但和氧的亲和力很弱，血红蛋白质分子各个亚基功能相同，都是运输O2和CO2。血红蛋白分子的四个亚基通过盐键彼此缔合，当一个α亚基与O2结合时发生构象的变化，盐键断裂，使整个血红蛋白分子的空间结构发生改变，由原来的紧密型变成松弛型，从而加速了其他3个亚基与O2的结合，对氧的亲和力增强。这一特性对红细胞内血红蛋白的运氧功能有重要调节作用。
蛋白质分子因与某种小分子物质相互作用发生空闯结构变化，从而改变了该种蛋白质与其他分子进行反应的能力，这种现象称变构作用或变构效应。这种在生物体内广泛存在的变构调节机制充分说明了蛋白质的四级结构与功能之间的密切关系。
（第五节 ）蛋白质的性质
一、蛋白质的相对分子质量
蛋白质是高分子化合物，相对分子质量一般在1万～100万，甚至更大一些。这是蛋白质分子最突出的特性，并且不同种类的蛋白质分子的大小有一定差别。
蛋白质的相对分子质量很大，因此用测定小分子物质的相对分子质量的方法（如冰点降低，沸点升高等方法）都不适用。测定蛋白质相对分子质量的方法很多，除了根据蛋白质的化学成分来测定外，主要还是利用蛋白质的物理化学性质来测定。这些方法是渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，其中渗透压法较简单，对仪器设备要求不高，但灵敏度较差。
用凝胶过滤法和聚丙烯酰胺电泳所测定的蛋白质相对分子质量也是近似值，最准确而可靠的方法是超离心法，但需要超速离心机。此法基本原理是将蛋白质溶液放在超速离心机中以60000～80000r／min的速度旋转，产生强大的离心力。由于蛋白质分子的密度大于溶液的密度，使蛋白质颗粒从溶液中沉降下来。又可用光学方法观察旋离过程中蛋白质颗粒的沉降行为，从而判断出蛋白质的沉降速度，根据沉降速度再计算出蛋白质的相对分子量。
超速离心机最初是Svedberg于1940年设计制造的。一般把单位（厘米）离心场力的沉降速度称为沉降系数，用S表示。其度量单位以秒计。1个S单位，为1×10-13s，因此，8×10-13s的沉降系数用8S表示。可用S值表示蛋白质分子的大小，S越大，蛋白质的相对分子质量越大；S越小，相对分子质量越小。蛋白质的相对分子质量可直接用沉降系数表示，也同样可用S值表示其他生物大分子的大小。
二、蛋白质的两性解离和等电点
蛋白质分子和氨基酸类似，也是一种两性电解质，具有两性离解和等电点的性质。蛋白质在溶液中被鳃离成正离子或负离子，主要受溶液的pH值的影响。
蛋白质在溶液中的带电状态主要取决于溶液的pH值。当蛋白质所带的正、负电荷数相等时，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点，用pI表示。不同的蛋白质各具有特定的等电点。
在等电点时，因蛋白质所带净电荷为零，不存在电荷相互排斥作用，蛋白质颗粒易聚积而沉淀析出，此时蛋白质的溶解度、黏度、渗透压、膨胀性及导电能力等都最小。若蛋白质溶液的pH值小于等电点，则蛋白质主要以阳离子形式存在，在电场中向负极泳动；反之，若蛋白质溶液的pH值大于等电点，则蛋白质主要以阴离子形式存在，在电场中向正极泳动，这种现象称为电泳。不同的蛋白质其颗粒大小、形状不同，在溶液中带电荷的性质和数量也不同，因此它们在电场中泳动的速率必然不同，常利用这种性质来分离提纯蛋白质。
人体内各种蛋白质的等电点不同，大多数均偏弱酸性，pI为5左右，所以在人体体液pH=7．4的环境中，体内蛋白质解离成带负电荷的负离子。
三、蛋白质的胶体性质
蛋白质分子的相对分子量大，分子颗粒的直径一般在1～100nm之间，属于胶体分散系，因此蛋白质具有胶体溶液的特性，如布朗运动、丁达尔效应以及不能透过半透膜、具有吸附性质等。当蛋白质分子在水溶液中时，暴露在分子表面的许多亲水基团（如氨基、羧基、羟基、巯基以及酰胺基等）可结合水，使水分子在其表面定向排列形成一层水化膜，将蛋白质分子互相隔开，从而使蛋白质颗粒均匀的分散在水中难以聚集沉淀。同时，蛋白质溶液在非等电点时，其分子表面总带有一定的同性电荷，同性电荷相斥而阻止蛋白质分子凝聚，相同的电荷还与其周围电荷相反的离子形成稳定的双电层，这些是蛋白质溶液作为稳定的胶体系统的主要原因。
人体的细胞膜、线粒体膜、血管壁、肾小球基底膜、腹膜等都是具有半透膜性质的生物膜，蛋白质分子有规律地分布在膜内，能使蛋白质和小分子物质分开，对维持细胞内外的水和电解质平衡具有重要的生理意义。临床上使用的腹膜透析、血液透析就是利用了蛋白质不透过半透膜的原理。
四、蛋白质的沉淀作用
维持蛋白质溶液稳定的主要因素是蛋白质分子表面的水化膜和所带的电荷，如果用物理或化学的方法破坏稳定蛋白质溶液的这两种因素，则蛋白质分子发生凝聚，并从溶液中沉淀析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。使蛋白质发生沉淀的方法有多种，例如，在蛋白质溶液中加入适当的脱水剂去除蛋白质分子表面的水化膜，或改变蛋白质溶液的pH值达到其等电点，而使蛋白质呈等电状态，蛋白质就会相互凝聚，沉淀析出。
对于不同的蛋白质胶体溶液所采用的沉淀方法不同，有些蛋白质（如白明胶）两种稳定因素的作用都很强，只有两种因素都被消除后才会产生沉淀；有些蛋白质只有一种因素起主要作用，此时只要去除这种主要的稳定因素，蛋白质就可以发生沉淀。如酪蛋白溶液，将其pH值调至等电点时即产生沉淀，这表明酪蛋白胶体溶液的主要稳定因索是电荷的影响。沉淀蛋白质的方法有下列几种：
1.盐析法
向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，而使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析。常用的盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠和硫酸镁等。盐析作用的实质是破坏蛋白质分子表面的水化膜并中和其所带的电荷，从而使蛋白质产生沉淀。不同的蛋白质其水化程度和所带电荷也不相同，因而所需的各种中性盐的浓度各异，可以利用此种特性，调节盐的浓度使不同的蛋白质分段沉淀析出，达到分离蛋白质的目的，这种蛋白质分离的方法称为分段盐析。如在血清中加入硫酸铵至浓度为2．0mol／L时，球蛋白首先析出；滤去球蛋白，再加入硫酸铵至浓度为3．3～3．5mol／L则清蛋白析出。
在低温下，短时间内应用盐析法所沉淀的蛋白质，仍保持原有的生物活性并不变性，经过透析法或凝胶色谱法除掉盐后的蛋白质又能溶于水。盐析法是一种有效的分离提纯蛋白质的方法。
2.有机溶剂沉淀蛋白质
在蛋白质溶液中加入乙醇、丙酮和甲醇等一些极性较大的有机溶剂时，由于这些有机溶剂与水的亲和力较大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜而使蛋白质沉淀。在等电点时加人这类溶剂更易使蛋白质沉淀析出。如果操作在冰冷的条件下进行，可保持蛋白质不变性。有机溶剂沉淀蛋白质也是常用的分离蛋白质的方法之一，但使用有机溶剂时，如不注意用量，容易使蛋白质的生物活性丧失，一般常用浓度较稀的有机溶剂在低温下操作，使蛋白质沉淀析出。
产生的沉淀不宜在有机溶剂中放置过久，以防止蛋白质变性而失去活性。医用消毒酒精就是利用变性的原理杀灭病菌的。
3.重金属盐沉淀蛋白质
蛋白质在pH值高于等电点的溶液中以阴离子的形式存在，当加入重金属离子，如Ag2＋、Hg2＋、Cu2＋、Ph2＋等（用M＋表示）能与带负电荷的羧基阴离子结合，生成不溶性盐而沉淀。
2蛋白质化学
这些沉淀剂容易使蛋白质变性。临床上利用生蛋清和牛奶作为重金属中毒的解毒剂，就是根据这个原理。
4.生物碱试剂或酸类沉淀蛋白质
蛋白质在pH值低于等电点的溶液中以阳离子的形式存在，当加入某些生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸、钨酸等）或某些酸类（如三氯乙酸、磺基水杨酸等）（用X表示）时，较为复杂的酸根离子能与带正电荷的蛋白质氨基结合，生成沉淀析出。
使用这类试剂往往会引起蛋白质变性，因而不适宜用于制备具有生物活性的蛋白质。在临床检验和生化实验中，常用这类试剂去除血液中有干扰的蛋白质，还可用于尿中蛋白质的检验。
五、蛋白质的变性作用
蛋白质分子在受到某些物理因素（如热、高压、紫外线及X射线照射等）或化学因素（如强酸、强碱、尿素、重金属盐及三氯乙酸等）的作用时，可改变或破坏蛋白质分子空间结构，致使蛋白质生物活性丧失以及理化性质改变，这种现象统称为蛋白质的变性。性质改变后的蛋白质称为变性蛋白。
蛋白质具有严密的立体结构，主要靠分子中的次级键和二硫键等在空间将肽链或链中的某些肽段连接在一起。在外界理化因素的作用下，这些键受到破坏，多肽链在空间的伸展从有规律的结构转变为松散紊乱的结构。变性后的蛋白质分子形状发生改变，原来包藏在分子结构内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而原来分子表面的亲水基团则被遮掩，使蛋白质水化作用减弱，蛋白质溶解度也减小。同时，由于结构松散而使分子表面积增大，流动阻滞，黏度也增大，不对称性增加，导致失去结晶性；并且由于多肽链展开而使酶与肽键接触机会增多，因而变性蛋白质比天然蛋白质更易被酶水解消化。变性作用使蛋白质分子的空间结构遭受破坏，从而使酶、抗体、激素等失去活性。