朱厚看到了这道疏文后，十分生气，把奏疏丢在地上，表示对海瑞的愤慨。但想了一想，却又捡了起来，觉得海瑞的言辞确是击中了自己的要害，便叹口气说：“此人倒比得上比干，只是我并不是商纣王啊！”但朱厚还是不能原谅他，下令“赶快把海瑞抓起来，不要让他跑掉！”宦官黄锦佩服海瑞的骨气，想袒护他，就告诉朱厚Γ说海瑞是书呆子，上疏之后，连棺材都买好了，看样子是不会逃跑的。海瑞虽没有立即被抓起来，但过了几天，皇帝还是命令把海瑞交锦衣卫讯问，定了死罪。海瑞下了诏狱，朝野对他都无限同情，但都恐惧朱厚Φ牟斜，不敢吭声。挺身出来相救的只有户部司农何以尚，他上疏要求释放海瑞，余怒未消的朱厚α⒓疵令将他逮捕入狱，严刑逼供。徐阶当时在京任首辅大臣，他比较正直，有时乘工作之便，也在朱厚γ媲疤婧Ｈ鹂脱。徐阶很委婉地对朱厚λ担骸跋裾饫嗖菀凹淅吹氖樯，不过是明晓得你皇上圣明，冒冒险来沽名钓誉罢了，你不如干脆不加罪，这样他就失算了，而大家一定更歌颂您的德被四海。”经过徐阶的再三劝解，后来朱厚τ稚晕冷静地再仔细阅读这份奏疏，不得不承认海瑞对自己是忠心的，不过过分е绷诵┒已。朱厚υ经私下对徐阶说：“现在天下人都恨我不革新政治，从奏疏里也可以看得出来，这个海瑞所说的都对。”朱厚觉得杀了这样一个人可能大失人心，结果海瑞虽被判了死刑，关在牢里，朱厚σ恢泵挥蟹⒉贾葱兴佬痰拿令。
嘉靖四十五年（公元1566年）冬天，朱厚Σ∈拧Ｓ吏知道海瑞不但要获释，而且还要当官，就置办酒席来请海瑞。海瑞以为是自己要执行死刑，便坦然地想做个饱死鬼。后听说朱厚σ阉溃海瑞痛苦不已，把刚才吃的东西全都吐了出来。没有几天，海瑞被释，复任户部云南司主事，随后又改任兵部武库司主事。隆庆元年（公元1567年），他被调到专管皇帝玺印的尚宝司为司丞。这年冬天，海瑞调任南京右通政。隆庆三年（公元1569年）六月，海瑞调升右佥都御史，钦差总督粮道，巡抚应天十府。海瑞的很快提升，多得益于徐阶、朱衡等人的提携。
应天巡抚辖应天、苏州、常州、镇江、松江、徽州、太平、宁国、安庆、池州十府及广德州。应天十府素有鱼米之乡之称，海瑞到任后发现江南的粮差繁重不仅位居全国之冠，而且是从古所未有，平民生活穷困得无以复加。恰巧这一年又发生严重水灾，市场上粮价飞涨，老百姓纷纷走上逃亡或抢劫的道路。海瑞原本想从附近地区调运粮食来调剂，但周围各地也同样遭灾。于是他决定用将供给京中五府六部衙门的禄米改折现金的办法解决，而把禄米留下来作为江南百姓民食之用。海瑞的请求被批准，这一措施解决了灾民们的燃眉之急。
解了燃眉之急，海瑞又着手从根本上解决水灾问题。他发现水灾发生的原因是水利失修、河道淤塞，以致排水不畅。于是海瑞决定对太湖通海的吴淞江加以疏浚。经费的来源是巡按衙门暨所辖府县衙门各项罚款和没收归公的赃款以及仓储的余粮，加上历年来应该用在水利方面而并未动用的款项。以本来需要救济的饥民为劳动力来源，按工发给他们银两和米。
隆庆四年（公元1570年）一月，疏浚吴淞江工程开工，由苏州府推官龙宗武、松江府同知黄成乐负责指挥，海瑞自己坐在一只小船上，时常往来江面各处巡视。疏浚吴淞江本来是两岸百姓多年的期望，因为地方官的腐败，使他们的希望年年落空。现在看见巡抚海瑞发动这一工作，并且亲自参加，使他们大为振奋，因此工作进展极快。
在吴淞江疏浚工程结束之前，海瑞又利用没有参加吴淞江工程的劳动力疏浚白茆。白茆是三吴入海最北面的一条河，淤积非常严重，最阔的地方不过四丈，深不过四尺，狭的地方只有二丈。海瑞又用以工代赈的办法，使工程进展很快，但由于后来海瑞突然被解职，没有能全部完工。
海瑞疏浚吴淞江和白茆得到了江南老百姓的称道，就连一贯对海瑞没有好感的江南大地主大官僚也充分肯定海瑞的举措。松江人何良浚说：“前年海刚峰来巡抚，遂一力开吴淞江。隆庆四年、五年皆有大水，不至病农，即开吴淞江之力也。非海公肯担当，安能了此一大事哉！”见何良浚的《四友斋丛说》卷十四。有个想陷害海瑞的按抚也私下惊叹说：“万世功被他成了。”
在应天巡抚，海瑞除兴修水利外，还在治狱方面下了大功夫。海瑞一到任，所有被判处斩绞等刑的犯人差不多都向海瑞诉冤。为了进一步弄清情况，海瑞一方面严禁诬告，一方面规定除初二、十六外，凡属人命、强盗、贪官案件可以随时来告。同时禁止士大夫互通关节，规定凡是乡官、举人、监生到衙门拜见官员，或派人投信的，都必须由门人作详细登记，其内容不能隐瞒。这样可以防止绅士干扰办案。
海瑞巡视到松江府时，华亭县农民前来控告乡官侵夺民田的达万人之多。更有一种越来越趋严重的土地集中情况，农民的负担本来不轻，由于粮官粮差不敢向乡官和富豪按实征收，就只有在老百姓头上加重剥削以足数。老百姓无路可走，有的只有把田抵押或奉献给乡官和富家，自己充当佃户。海瑞看到了问题的严重性，对土地兼并断然处置，勒令乡官将侵夺的民田全部归还农民，假使当初是抵押的，则让农民以较低代价赎回。
在华亭县，侵占土地最多的是徐阶和他的弟弟徐陟，他们侵占土地之后，还仗势拒缴赋税。徐阶的儿子更是横行乡里，无恶不作。徐阶一家的所作所为引起了老百姓的愤懑和仇恨，就连徐阶的亲友门生也向徐阶及其兄弟子侄提出忠告。海瑞看到这种情况，实在忍无可忍，虽然徐阶对自己有过救命的大恩，还是采取了断然处置，勒令徐阶、徐陟兄弟退还侵占民田。徐阶知道海瑞一向铁面无私，只得稍微退了一些，想就此敷衍了事。并且推诿大部分田是儿子名下的，不好作主。海瑞并没因此罢休，他写了封信给徐阶，信中说：“近阅退田册，知盛德出人意表，但所退数不多，再加清理，行之可也。昔人改父之政，七屋之金须臾而散，公以父改子，无所不可。”见《海忠介公全集》卷五中《复徐存斋阁老》。徐阶不得已，只好退出侵占的大部分民田。对于徐阶那几个无恶不作的儿子，海瑞也没有姑息迁就。海瑞依法将徐阶的大儿子徐摇⒍儿子徐琨以及十多个豪奴判了充军罪，将其三儿子徐瑛革职为民。许多豪绅地主看到海瑞对曾任内阁首辅多年又是自己救命恩人的徐阶尚且毫不通融，于是纷纷主动将侵占民田退出来。海瑞的退田还民取得了成效。
过去江南地区为了防御倭寇，招募了一批募兵，但这些人绝大部分都是游手好闲的无赖恶少，打起仗来他们不能冲锋陷阵，鱼肉百姓倒是他们的专长，成为社会治安的隐患。老百姓在兵役方面本来就要负担各级政府的养兵费、壮丁费，再加上募兵的费用，自然沉重不堪。海瑞认为靠募兵保护地方不可能有什么效果，于是下令将募兵遣散，仍然用民兵防守本乡本土。
海瑞在应天巡抚任上，大力推行一条鞭法。一条鞭法，亦称一条编法，当时是一种新的赋役制度。明代田赋主要是夏税与秋粮。夏税以小麦为主，秋粮以米为主，征收小麦与米，称为“本色”，将小麦、米折算成绢、丝、钱、钞等物缴纳，称为“折色”。徭役分以户为单位的“里甲”和以人丁为单位的“均徭”，同时还有临时性的“杂役”。征收赋税和徭役的依据是黄册和鱼鳞图册。地方官吏为了达到贪污和逃避赋役的目的，便将黄册和鱼鳞图册一改再改，将繁重的赋税和徭役转嫁到农民头上，使农民不堪重负，纷纷逃亡。
一条鞭法就是把过去田赋的各款项编在一起通计一省之丁粮，通派一省之差役，官收官解，除秋粮外，一律改折银两交纳。当时由于交通不便，运输费用往往超过赋税本身，改实物为货币征收，农民的运输费用降低，负担也自然减轻。至于徭役，新法实行后，银差、力差都只交银了事，农民可以安心生产，不受徭役之苦。一条鞭法的实行，大为减轻了雇农、贫农和一般市民的赋役负担，堵塞了官吏们贪污舞弊的某些漏洞，对当时生产力发展起了一定促进作用。