班超再次接受了使命，窦固想叫他多带些人马，他说道：“我只要带领原来跟从我的三十余人就足够了，如果发生意外，人多了反而更增加累赘。”当时，于阗王广德刚刚打败了莎车国，于是声威大振，雄霸南道，而北匈奴又派了使者来监护他。班超西行，首先到达于阗国，广德王态度礼节十分冷淡，而且这个国家的风俗很迷信神巫。神巫散布空气说：“天神发怒了，你们为什么想去归顺汉朝？汉使有一匹嘴黑毛黄的好马，你们赶快把它弄来给我祭祀天神！”于阗王广德听了就差人向班超索取那匹騧马。班超暗中已得知这一阴谋，但仍满口答应献出此马，只不过提出要让神巫亲自来索取才行。不一会神巫来到，班超立即砍下他的脑袋，亲自去送给于阗王广德，并就此事责备他。广德早就听说班超在鄯善国诛灭匈奴使者的事，因而非常惶恐不安，便下令攻杀北匈奴的使者而归降班超。班超重重赐赏了广德及其臣下，于阗国就这样安抚镇定了。
那时，龟兹国王建是在北匈奴支持下上台的，他依仗着北匈奴的势力，占据西域北道，攻破疏勒国，杀死国王，另立了龟兹人兜题为疏勒王。第二年春天，班超带领部下取道小路，来到疏勒国，离兜题所居住的槃橐城只有九十里，预先派部下田虑去劝告兜题降汉。还告诉田虑说：“兜题本非疏勒人，疏勒国民一定不会为他尽忠效命的，他如果不肯投降，就将他扣押起来。”田虑到达那里，兜题看到他孤单力微，一点也没有归降的意思。田虑乘他不提防，就突然上去擒获他并捆绑起来。兜题手下的人大出意外，都吓得逃走了。田虑派人飞马驰报班超，班超马上开赴城中，召齐疏勒文官武将，历数龟兹王兜题的条条罪状，另立原来国王的侄子忠做疏勒国王，疏勒人都兴高采烈。新国王忠和他的下属官员都请求杀掉兜题，班超不同意，为了显示威信于西域，反把他释放送走了。疏勒国因此与龟兹国结下了怨仇。
永平十八年，汉明帝去世。焉耆国借中国国丧机会，便攻陷了西域都护陈睦的驻地。班超孤立无援，而龟兹、姑墨两国又屡屡发兵攻打疏勒国。班超固守槃橐城，与疏勒王忠互为首尾，但兵少势单，一直坚守了一年多。汉章帝当时刚刚登基，考虑到陈睦全军覆没，恐怕班超势孤力单，难以立足下去，就下诏召回班超。班超出发回国时，疏勒全国上下都感到担心害怕，一个名叫黎弇的都尉说道：“汉使若离开我们，我们必定会再次被龟兹灭亡。我实在不忍心看到汉使离去。”说罢就拔刀自杀了。班超回国途中来到于阗国，国王以下的人全都悲号痛哭说：“我们依靠汉使，就好比小孩依靠父母一样，你们千万不能回去。”而且还紧紧抱住班超坐马的脚，使马无法前行。班超看到于阗国民坚决不让他东行归汉，又想实现自己最初的壮志，于是改变主意返回疏勒。疏勒国中有二座城池自从班超离去，又重新投降了龟兹国，而与尉头国联兵叛汉。班超捕杀了叛降者，又击破尉头国，攻杀六百余人，疏勒国重新安定下来。
章帝建初三年，班超率领疏勒、康居、于阗和拘弥等四国军队一万多人，攻占了姑墨的石城，杀敌七百余人。班超想要就此平定西域诸国，于是上奏朝廷，请求派兵说：“臣下曾经看到先帝想打通西域，因而向北进击匈奴，向西域派出使者，鄯善国和于阗国当即归附汉朝。现在拘弥、莎车、疏勒、月氏、乌孙、康居等国又愿意归顺汉朝，共同出力，攻灭龟兹，开辟通往汉朝的道路。如果我们攻下了龟兹，那末西域尚未归服的国家就屈指可数了。臣下心中独自思量，我虽然原是个军中小吏，却很想象谷吉那样在远方为国效命，象张骞那样在旷野捐躯。从前魏绛只是一小国的大夫，还能与诸戎订立和盟，何况我今天仰承大汉的声威，难道不能竭尽铅刀一割的作用吗？前汉议论西域形势的人都说只有联合了三十六个国家，就称得上折断了匈奴的右臂。现在，西域的各个国家，那怕是极边远的小国，没有不愿意归附汉朝的，大小国家都十分高兴，自愿进贡的络绎不绝，只有焉耆、龟兹二国不服从我们。臣下先前曾和三十六个部下奉命出使西域，历尽艰难危困，自从孤守疏勒以来，至今亦已五年，对于西域的情况，我较为熟悉。曾经问过大小城廓的人，都认为依汉与依天一样可靠。由此看来，葱领的道路是可以打通的；葱领一通，那么就可以攻伐龟兹了。现在我们应该封龟兹国的侍子白霸为龟兹国王，派几百名步骑兵护送他回来，与其它各国军队联合作战。要不了多久，就可以擒获现在的龟兹王。以夷狄攻夷狄，这是最好的计策啊。臣下看到莎车、疏勒两国田地肥广，草茂畜繁，不同于敦煌、鄯善两地。在那里驻军粮食可以自给自足，不须耗费国家的财力物力。而且，姑墨、温宿二国国王又全是龟兹国所册立的，既不是那两国的人，就会进一步相互对立和厌弃，这种情况必定会导致反叛和出降，如果这两国归降我们，那么龟兹自然可以攻破了。我希望朝廷发下臣的奏章，看能否参照办理，如果万一获得成功，我就是死了又何恨之有？臣下区区之身，承蒙上天保祐，暗中希望不至于马上就死，能够亲眼看到西域平定、陛下举起预祝万寿无疆的酒杯，向祖庙报功，向天下宣布特大喜讯的日子。”
奏章上达以后，汉章帝觉得这事情可以成功，就商议要派兵支援班超。平陵人徐干一向与班超志同道合，他上书给皇上，自告奋勇前去帮助班超。建初五年，章帝就封徐干为假司马，让他率领减刑的罪犯和自愿出塞的兵士一千人赶赴班超驻地。起先，莎车国以为汉兵不会到来，便投降了龟兹国，而疏勒国的都尉番辰亦因此反叛，正好这时徐干率军赶到，班超就与他一起先打击番辰，大获全胜，杀敌一千余人，活捉了很多俘虏。班超攻破番辰之后，想乘胜进攻龟兹国，但考虑到乌孙兵力强大，理应借助他的力量，于是又上书朝廷道：“乌孙是西域大国，拥有十万军队，因此武帝时曾将细君公主远嫁和亲，后来终于在宣帝朝得到过乌孙兵的援助。如今还需要朝廷派遣使者去招抚慰问，以使乌孙国能与我们同心协力，攻打龟兹。”章帝采纳了这个建议。建初八年，晋升班超为将兵长使，并破格使用鼓吹幢麾，又晋升徐干为军司马，另外派遣卫侯李邑护送乌孙使者回国，携带去赠送给大小乌孙王及其部属的许多礼物。
李邑刚行至于阗国，正碰上龟兹在攻打疏勒国，他吓得不敢继续前进，就上书说开通西域的事业难以成功，又竭力诽谤班超，说他拥爱妻、抱爱子，在西域享乐，根本无意为国效忠。班超知道这事之后，慨叹地说：“我本非德行高尚的曾参，如今又有接二连三的谤言，恐怕难免被朝廷上下怀疑了。”于是，便舍弃了爱妻。章帝知道班超一向忠诚，所以严厉地责备李邑道：“纵然班超拥爱妻、抱爱子是真的，但一千多思乡念土的部下，为什么都能与他同心同德呢？”并命令李邑到班超属下，听从班超的指挥调迁。还另有文书通知班超：若李邑能在西域任职，便留他共事，不行便遣送回国。班超得令就派李邑带领乌孙国的侍子还归京城。徐干见了对班超说：“李邑在于阗时曾亲口说你的坏话，想要败坏沟通西域的大业。如今你何不依照皇上命令把他留在这里，而另外派人护送乌孙国侍子回洛阳去呢？”班超回答说：“你怎么讲这样浅陋的话呢？正因为李邑毁谤过我班超，所以今天才让他回去。只要我问心无愧，为什么害怕人家的坏话呢？如果为了泄愤而留住他，就不是忠臣了。”
第二年，朝廷又派遣假司马和恭等四人率领八百兵士前去协助班超，班超便发动疏勒、于阗兵攻打莎车王。莎车王暗底里派使者串通疏勒王忠，以重利诱惑他，疏勒王忠便决定反叛，勾结莎车王西逃，固守乌即城。班超于是另立疏勒王室的府丞成大为疏勒王，将不愿谋反的人全部调动起来攻打叛王忠，双方相持了半年，因为康居王派精兵援救，班超难以攻取乌即城。这时，月氏王与康居王联姻不久，关系很亲密，班超就派人赠送很多金银锦帛给月氏王，让他劝止康居王。康居王便撤了兵，还生俘了叛王忠，把他押回疏勒国，乌即城便只好向班超投降。又过了三年，忠去游说康居王，向他借兵回国，占领了损中，并暗中与龟兹勾结，派人向班超假投降，班超心里知道他们的阴谋，但表面上假装答应接受投降。忠一听大喜，马上带领轻骑来见班超。班超暗中埋伏下军队等候着，设下营帐，奏乐接待，酒过一巡之后，就高声喝令部下将忠捆起来斩首，并就势击溃忠的随从，歼敌七百余人。西域南道就此畅通无阻。