由于此画放在食堂墙壁上，正中还有一门。后来那修士敲厨房的门，使画受震，画的下部遭到破坏，墙也受到损坏，颜料层脱得厉害，加上厨房蒸汽落到画面上，加速了作品的毁坏。后来人们进行过拙劣的修复工作，极大的歪曲了原作。
1443年法军在轰炸米兰时，因炸弹落到修道院院子里，这座食堂被炸毁了。而画了《最后的晚餐》的这面墙得以保全下来。
此建筑物于1446年修复。1454年，专家使用最新方法，成功地复原了这幅画，弄掉了后来画上去的东西，显示了由达·芬奇的手画上去的颜色，终于使这幅轰动米兰的杰作，恢复了原貌。
混乱的米兰使艺术家觉得惶惶不可终日。
是该动身的时候了。
达·芬奇在米兰第一时期即将结束。
这是他的全盛时期。标志这期间的辉煌艺术成就的就是壁画《最后的晚餐》。
他还为宫廷演出“丹娜族”戏而设计了布景。
值得一提的是：数学家、教授卢卡·巴却里迁居米兰，与他结为挚友。
到1499年法国人统治米兰，这是达·芬奇艺术、科学硕果累累的“第一米兰时期”。
《蒙娜·丽莎》
回到佛罗伦萨后，达·芬奇开了个画室，并接受了几件订货。
一天，达·芬奇接到佛罗伦萨著名银行家佐贡多的邀请，到他家为他的夫人画像。
佐贡多先生年约45岁，人看上去很有精神，一个亮光光的秃顶。他礼貌地接待了达·芬奇，然后叫他的夫人蒙娜·丽莎出来和画家见面。
当美丽的夫人走进客厅时，连见多识广的达·芬奇也暗暗吃了一惊。她穿一件华美的连衣裙，卷曲的长发披散在双肩，有一种清水出芙蓉的韵味。她的脖子上、手上挂着一些贵重的宝石，显得雍容华贵。她腼腆地向画家走来，报以礼节性的微笑，这一瞬间被达·芬奇捕捉到了，这种微笑正是他一直在寻找的微笑。
“以后请您到这里来为她画像吧！”银行家说道。他已经结过三次婚，前两位夫人都在结婚不久去世了，第三次才娶了丽莎小姐，比他小十多岁，他一直以年轻的美妻为荣。“我可以为她画像，但不能在这里。要画肖像，必须有专门的画室，还是到我的画室去吧。”达·芬奇说道。
从此，蒙娜·丽莎常常和一个女仆来到达·芬奇的画室，让他画肖像。为了避免她在画像时感觉无聊，达·芬奇请来乐师、歌手、说书人和小丑到画室来，为她表演；同时，也可以使笑意能长久地保持在脸上。
达·芬奇细致而耐心地画着，3年过去了，还没有画完。到了后来，达·芬奇和蒙娜·丽莎之间似乎有了一种微妙的联系，她的脸上最微细的变化，都逃不过达·芬奇的眼睛。
一个晴朗的日子，蒙娜·丽莎坐在达·芬奇面前，略低着头，抚摸着她心爱的白猫，那纤细的手指在柔软的皮毛映衬下，显得格外温柔。达·芬奇拿起画笔开始工作，突然，他停住了。
“夫人，”他问，“您今天有什么不舒服吗？”
丽莎夫人抬起头，安静地看着达·芬奇，“是的，有一点儿，女儿生病了，我整夜没有睡觉。”她说的女儿并不是自己亲生的，而是丈夫前妻的女儿。
“您今天也许疲倦了，这样坐着是很累的，我们今天不画了吧？”
“不，不要紧，这样好的天气，不画，您会难过的。”她望着达·芬奇，脸上带着一丝理解的笑意。
达·芬奇点点头，又拿起了画笔。长期以来，两人中间，无须说一句话，只须示意一下，便能相互了解。
“讲个故事给我听吧！”丽莎夫人请求道。她不再需要达·芬奇为她请什么歌手和小丑之类，就喜欢听他讲故事，尤其喜欢听他讲自己的回忆、游历、自然观察，以及绘画计划等。他常常用简单的小孩子般的字句，配着轻轻的音乐，将这些故事讲给她听。
于是，达·芬奇给她起了美丽的“维纳斯”的故事。
达·芬奇轻轻地讲着，丽莎夫人那双明亮的眼睛望着他，好像已经脱离了现实，来到一个美丽的神话世界。那种神秘的微笑不知不觉又浮现在她的脸上，这是一种完全透明的、非常深沉的，任何人都不能探究到底的静水般的微笑。达·芬奇抓紧时机，全神贯注地画着……
达·芬奇看出来，丽莎夫人不仅想成为他的肖像画上的主人公，还想成为他生活中的朋友。但她已经是别人的妻子了，而自己的年龄又比她大许多。他克制着自己的感情，仅仅以一个画师的身份出现在她画前。
这时候，达·芬奇接到宫廷里传来的一个通知，让他离开佛罗伦萨，去管理一个正在紧张修建的运河。这是一件十分重要的事，必须很快出发。达·芬奇知道自己将要暂时离开丽莎夫人，心情很不平静，明天就是最后一次为丽莎夫人画像了，他觉得自己竟有些舍不得离开她了。
第二天是个画像的好天气，这天，丽莎夫人准时来到画室。但和往常不一样的是，这次她是单独一个人来，没有带女仆，她那明亮的眼睛，此时像有一丝水雾在幽幽地飘着。
画室中只有他们两人。
达·芬奇认真地画着，丽莎夫人带着微笑，直盯着他的眼睛，这也是以前没有过的。突然，他发现丽莎夫人脸上闪过一种奇异的阴影，就好象一个人在镜面上吹气所留下的痕迹一般。他停下来，问道：
“怎么啦？”
她不做声。很久才反问：“您要到运河上去，明天动身吗？”
“不，今天夜里就得走。”
“噢，我马上也要离开这里了。”她说。
达·芬奇看着她的眼睛，明白了，她之所以要离开佛罗伦萨，是因为知道了他要离开。
“佐贡多先生为了一件生意上的事情，要到外地去住三个月，我让他带我去，秋天才回来。”她解释说。
“好吧，”达·芬奇放下画笔，说道：“三个月后，我再来画。”
“不，经过三个月，我也许完全改变了，甚至您都会认不得我了。您说过，人的面貌，尤其是女人的面貌，改变得很快。所以，您不如今天就完成这幅肖像。”
“啊……”达·芬奇久久地看着丽莎夫人，说不出一句话来。他们都有一种预感，这次分别将是永久的，就像死去一样。他和丽莎夫人将来惟一的联系就是眼下这幅肖像了。
“是时候了，再见，达·芬奇先生。”丽莎夫人站了起来，同往常一样平淡地说道。她的眼神中似乎含着一丝责怪，责怪达·芬奇三年来在感情上的过分克制。
达·芬奇的杰作《蒙娜·丽莎》是文艺复兴时期最出色的肖像画之一，也是人类文化宝库中最珍贵的瑰宝之一。
这幅肖像画最重要的特征是蒙娜·丽莎的微笑。
那么，达·芬奇为什么一定要画蒙娜·丽莎的微笑呢？这里蕴藏着画家极为可贵的创作意图：在中世纪的黑暗岁月，西欧人经历了1000多年残酷蒙昧的封建统治和基督教禁欲主义的精神摧残，早已丧失了思想自由和幸福生活的权利。现世生活的一切喜怒哀乐都会被视为触犯上帝的天条。所以在中世纪的画像中，圣母、耶稣也好，普通的肖像也好，总是那样呆板、僵硬，面部毫无表情。文艺复兴的时代来了！一切都在发生变化，绘画中变化最明显最典型的标志，便是丧失已久的笑容又回到人间，特别是回到获得解放的妇女们的脸上。那笑容里充满着新时代新人物的自信和乐观，洋溢着他们对未来、对真善美的渴望。达·芬奇作为一个与时代休戚相关的艺术家，敏锐地感受到这一点，并天才地表现了这一点。他一扫过去肖像画上那郁郁寡欢、像幽灵一般的阴影，绘出自由的明朗笑容。他用艺术形象表明，人从禁欲主义下解放出来，它不再是徒具形质、没有七情六欲的模具，人能够向人微笑了！所以《蒙娜·丽莎》具有了强烈的特征，而且成为文艺复兴时期女性美的原型，成为画家可以放开手脚倾心颂扬真善美的象征，成为西欧人结束了中世纪漫长痛苦生活的标志。
另一说认为，“蒙娜·丽莎”这个名字可能是取自马童娜（Madonna——即圣母马利亚）的简写“Mona”，马童那本来是圣母的画像（或雕像）的通称，这样《蒙娜·丽莎》便多少带有圣母画像的含义了。
如果这一说符合历史的事实，《蒙娜·丽莎》这幅画的意义仍然不因此而减少。因为在“黑暗的中世纪”里，传统的宗教题材霸占了整个的画坛，形成抽象化、概念化的公式。那里的圣母画像，历来是头上带着“圣光”，冰凉而毫无生命。文艺复兴的大师们，特别是达·芬奇，敢于向这种僵死的传统挑战，他们把神圣不可侵犯教义变成平易近人的通俗故事，开始把宗教与世俗生活联系起来，使艺术只是披着宗教的外衣，反映的是现实的生活呼唤世俗的思想感情，目的是向人民群众进行人文主义的宣传教育。把宗教题材世俗化，这是狂飚突进的文艺复兴时期的一个浪潮。达·芬奇在《蒙娜·丽莎》中抹掉了圣母头上的圣光，使冰冷的圣母具有“人性化”的特征，用“人性”代替了“神性”，或者说，人也可以具有神的特质，这就更是一个了不起的成就了。
狄德罗说过：“所有模仿的艺术都能在自然里找到它的模型。”达·芬奇创作杰作《蒙娜·丽莎》时，为了表现她那种似笑非笑的微妙特征，不仅运用解剖学的知识深入研究了隐藏在皮肤下面的脸部肌肉的活动特征，而且十分细微的观察了许多自然现象。他终于从微风吹起湖水的涟漪中得到启发，创作了蒙娜·丽莎的谜一般的微笑。你看她那配合着微微斜视的柔和明亮的眼神，抿着的嘴角微微翘起，形成轻盈的笑靥，这种非人工所为的线条和韵味，我们只能从“风乍起，吹皱一池春水”中找到类比。蒙娜·丽莎的微笑中显示出温雅、高尚、快乐，但不失其端庄、宁静。这是寓有深刻意义的最美的微笑。