1875年，巴甫洛夫以优异的成绩毕业并获得自然科学硕士学位。齐昂教授早已看中这位才华出众的青年，他聘请巴甫洛夫到自己主持的外科医学院（后改名为军事医学院）生理学研究室任助教。1876年巴甫洛夫又去了这个学院兽医学部生理实验室任实验员，他在乌斯齐莫维奇教授的领导下，开始进行血液循环生理学的研究。
1878年，巴甫洛夫接受了俄国著名临床医学家彼·鲍特金教授的邀请，在他诊所的实验室进行研究工作。在这里，他主要研究血液循环、消化生理、药理学方面的问题。1879年，他做了第一个著名的手术，在胰腺里装一个固定的瘘管。因科学研究成绩出色，又一次获金质奖章，以后经考试合格又留院深造两年，继续在鲍特金实验室工作。巴甫洛夫自进入这个实验室就是领导者，他在实验室里担任青年进修医师的指导老师，十多年富有成效的辛勤工作，为他奠定了成为一名卓越生理学家的基础。
1881年，巴甫洛夫与学教育的卡尔捷夫斯卡娅结婚，由于生活拮据，为节省开支，巴甫洛夫不得不把妻子送到农村的姐姐家中。
1883年，巴甫洛夫写了《论心脏的离心神经》博士论文，同年5月21日进行论文答辩，顺利通过并获得医学博士学位。1884年，任彼得堡大学生理学讲师。
1888年，他发现了调节胰腺分泌活动的神经，完成了著名的“假饲实验”。1889年，他做了第二个有名的手术即食道手术。由于这些成就，巴甫洛夫不仅在国内，而且在国外也有声誉。1890年4月24日，巴甫洛夫被任命为军事医学院药理学副教授。1891年，又兼任新成立的实验医学研究所生理学部主任，组织与领导生理学的研究工作。1897年，出版了《关于主要消化腺工作讲义》，这是巴甫洛夫一生中的重要著作之一，先后被译成几国文字，成为生理学研究的指南。
1904年，巴甫洛夫获诺贝尔生理学和医学奖，以表彰他在消化系统生理学方面取得的开拓性的研究成就。他是俄国第一个荣获诺贝尔奖的科学家，也是世界上第一个获得诺贝尔奖的生理学家。
从1904年，到他逝世前三十余年间，巴甫洛夫转向大脑皮层的生理研究。在苏联政府和列宁的直接关怀下，1923年，他出版了《二十年来对动物进行高级神经活动的客观研究的实验》专著，这是一部浸透着巴甫洛夫研究心血的结晶。1927年，他又出版了《大脑两半球工作讲义》。
1924年苏联科学院为他新建了一个以他的名字命名的生理学研究所。1929年，又在列宁格勒附近的科尔托村为他建立了一个世界上独一无二的生理学研究中心——巴甫洛夫村。
1936年2月27日，这位伟大的生理学家因患流感性肺炎逝世。在他逝世前不久，他还时刻不忘未来的祖国建设者，他热情洋溢地给苏联青年写了封信，信中写道：“循序渐进，循序渐进，再循序渐进。……”等名言。我们虽然失去了这位科学巨人，但他留下的精神财富却取之不尽。
学术成就
巴甫洛夫在生理学领域中的研究十分广泛，涉及生理学的各个部分，集中体现在三个方面：
血液循环生理学、消化系统生理学、高级神经活动生理学和大脑生理学。
（一）血液循环生理学
巴甫洛夫从事血液循环生理学的研究是在他开始科学研究工作的最初15年（1874年～1888年），也就是在鲍特金临床病理实验室工作期间。他创造并应用了一种全新的生理学实验法，这种实验法称慢性实验法，与传统的急性实验法相区别。
在当时，生理学家普遍以孤立的、静止的观点来研究动物的一些器官的生理功能。他们利用物理和化学的方法，从活着的或死去的动物身上取下研究对象，置于人工环境下，设法在短时间内保持它的生理机能，对其进行实验；或用麻醉剂、破坏大脑等方法使动物失去知觉和生存能力，再进行解剖，观察研究对象的机能，这种实验方法称为急性实验法，又称分析实验法。
巴甫洛夫不太欣赏急性实验方法，认为这种实验方法破坏了动物的整体性，具有一定的局限性。他创造了一种慢性实验法来弥补急性实验法的不足。所谓慢性实验法就是在正常的、未经麻醉的、健康的动物身上进行研究的方法。巴甫洛夫耐心地训练动物，使它们能在实验台上安静地忍受复杂的实验手术，这样动物在完全清醒和正常的条件下被研究，整个中枢神经系统很正常，因此所得的结果能完全反映出在整体内所研究的器官与各种系统保持复杂的相互关系时的活动情况。例如，他在清醒的动物身上剖开动脉，连上血压计，记录血压，探讨调节血压的机制。
他在《论心脏的离心神经》的博士论文中，第一次论证了神经对心脏功能的调节作用。他认为是由四条神经对心脏功能发挥阻止、加速、抑制和兴奋作用，这是以前人们没有发现的。
以后巴甫洛夫对心脏离心神经仍不断地进行研究。1888年，他发明了哺乳动物活动的离体心脏手术。用来研究各种药物对心脏作用的药理学和血液循环生理学上的一系列问题。他还发现这样一个事实：当血液流经肺部时，血液流动畅通；当血液不经肺部时，血液很快凝固。
他得出结论：当血液流经肺部时，有某种抗凝物质混入血液。多年后，科学家从肺组织中分离出一种强烈的抗凝物质，证明了巴甫洛夫的论断。以后，巴甫洛夫强调神经系统对机体活动过程的调节作用的思想，被学术界称为“神经论”，成为科学家建立神经系统营养性机能学说的基础。
（二）消化系统生理学
巴甫洛夫从1879年开始用了近二十年的时间集中精力研究消化生理学，以后在1906年～1911年进一步加强这方面的研究。他系统地研究消化生理的诸多方面，采用慢性实验法，创造了多种外科手术，导致把外科手术引进到整个消化系统研究领域，发现了主要消化腺的分泌规律，奠定了现代消化生理学的基础。
巴甫洛夫在健康的动物身体上安装瘘管，如胰腺瘘、唾液腺瘘、胆管末端瘘、食管瘘、胃瘘等导管。观察在任何时间内所收集到的纯净的消化液，获得了关于消化腺分泌全过程和消化液成分的基本材料，为搞清神经系统对整个消化过程的调节机制奠定基础。
1889年，巴甫洛夫对实验狗施行食管切断手术并安装胃瘘导管，应用著名的假饲法收集胃液并进而研究胃液分泌机制。这个实验非常成功，狗吃下去的食物自食管切断处落下，并没有进入胃，但假饲开始几分钟后，胃液开始分泌，并迅速增加，能持续几十分钟乃至几个小时。如果切断狗的迷走神经，假饲便不再引起胃液的分泌。通过实验，巴甫洛夫得出结论：食物引起味觉器官兴奋，这种兴奋通过味觉神经传至延髓，而后再由延髓通过迷走神经传至胃腺，也就是进行着从口腔到胃腺的反射。如将两条迷走神经切断，则反射不能完成，假饲时，胃腺便没有反应。
1894年，巴甫洛夫又成功地制成了分离小胃，以后被命名为“巴甫洛夫小胃”，简称“巴氏小胃”。他在动物胃上实施一个小手术，将动物胃的基底部分分割出一个不大的袋囊（巴氏小胃），巴氏小胃与胃体之间有共同的外壁，共同的血液循环和神经支配，但它们彼此却由内部粘膜层缝合成的“隔壁”分开。进入大胃的食物和唾液并不进入小胃，然而大胃与小胃的反射活动完全相同。通过多次实验证明：被吸收的食物数量、种类和胃液数量关系密切。
这个实验获得了关于消化腺分泌全过程和消化液成分的基本材料，为搞清神经系统对整个消化过程的调节机制奠定基础，对于营养学和医学有重要价值。
（三）高级神经活动生理学
从1903年起，一直到他生命的最后一刻，巴甫洛夫连续三十余年致力于高级神经活动生理学和大脑生理学的研究，从而发现了大脑皮层和大脑两半球活动的规律，建立了高级神经活动学说，也称大脑皮层的条件反射学说。
巴甫洛夫认为动物的一切行为都属于反射的范畴。他把反射分为非条件反射和条件反射两类。所谓非条件反射是动物天生的功能，具有永久性，不因环境改变而丧失这种功能的反射活动。例如，狗在进食时由于食物的结构和化学刺激，使口腔粘膜中的化学感受器兴奋，通过神经传导引起唾液腺分泌唾液，这种反射就是非条件反射。所谓条件反射是指后天形成的，经过多次强化，使本来无关的刺激也能引起反应的反射活动。例如，用与食物无关的条件如铃声来刺激狗，这时狗的唾液腺并不分泌唾液，但若把铃声和食物联系在一起，即每次给狗喂食前就响铃声，这样实验若干次后，只要单独用铃声就会使狗的唾液腺产生反应，分泌唾液，这就是条件反射。
巴甫洛夫发现了条件反射，即发现了动物界和我们人类本身基本的，同时也是最普遍的现象。研究表明，条件反射是建立在非条件反射基础上的一种暂时的联系，也就是在条件刺激的皮层兴奋灶与非条件刺激的皮层兴奋灶之间，由于多次结合强化，从而建立了暂时的神经联系。由此可知条件反射具有暂时性的特点。