在20世纪的最初10年，随着蛋白质学说的发展也产生了一些问题。其一，费歇尔的方法使他只能将某些氨基酸合成为多肽，他首次合成的18个氨基酸的多肽链只含有两种氨基酸（亮氨酸和甘氨酸），而大多数天然蛋白质是含有很多氨基酸的。其二，他的分离方法只能对天然蛋白质的氨基酸数目和种类作定量分析，而对这些氨基酸在整个肽链中的物理构型却全然不知。
由于发现任一特定的蛋白质总是产生数量大致相同的各种氨基酸，进而使人联想到，蛋白质具有一定的和重复的结构。有愈来愈多的有机化学家应用了费歇尔的方法。显然，胶体学派不得不放弃关于所有蛋白质均无一定结合顺序的断言。费歇尔坚信原子有实际结构这一点，为他研究蛋白质提供了一条比那些相信不可知论及烦琐的唯心论的化学家更确定、更迷人的途径。费歇尔的工作证明了生命过程可以还原成纯粹化学的相互作用。
费歇尔的蛋白质分子观，是20世纪头10年兴起的酶学说的一个重要组成部分。许多“酵素”被认为是蛋白质或是类似于蛋白质的物质。然而，没有任何迹象表明，蛋白质实际上是有一定组成的分子。用严格的化学方法去阐明酵素的催化作用总是比较困难的。那些曾拥护毕希纳酿酶学说的年轻、热情而激进的化学家，1897年后发现费歇尔工作中有一个著名的已确证的观点，这就是所有的生化、生理反应都是由专一的酶所控制的。
然而，在此期间，费歇尔的多肽研究工作也遇到了非难。费歇尔自己几乎没有意识到他的多肽学说对酶学说的巨大含义。虽然他相信，蛋白质的一般特性符合多肽学说，但他不相信：①所有、或大多数酶是蛋白质；②作为蛋白质的酶具有专一性。例如，1907年费歇尔（和其他人）主张，酶不是真正的专一性的蛋白质，而是很小的催化分子，它们粘附在一些蛋白质状的胶体物质上。事实上，当年费歇尔就被卷入到一场关于蔗糖酶（它催化某些糖降解）是不是蛋白质的争论之中。费歇尔认为，蔗糖酶的蛋白质成分并没有表现出专一性，并且可以用化学方法同酶的催化部分分开，因此，他认为蛋白质是一种被动的、与催化作用无关的载体。费歇尔虽然不是一个胶体学派的追随者，但在20世纪初，他还是不能完全摆脱胶体学派思想的束缚。20世纪初的头几十年，在能否认识到催化作用是由像蛋白质那样的大分子来执行这一点上，还存在着很大的知识方面的障碍。对于大多数工作者来说，有机催化剂不过是像无机催化剂铂金那样的、很小的分子。
费歇尔的研究有几个方面被承袭下来了。他所使用的精确的定量方法，为有机化学、特别是为蛋白质化学建立了一套新的标准。20世纪初，这些方法对于与蛋白质研究紧密相关的各个生化领域都产生了相当大的影响。费歇尔的方法，尤其是人工合成多肽的方法，亦为探讨蛋白质分子的精确结构和确切组成（即分析和合成）开辟了一条新的途径。当时，还没有一定的方法能证实费歇尔的研究。比如，他提出自然界中的蛋白质是以肽键相连而形成，如同实验室中合成的含有18个氨基酸的肽一样，这样的观点就无法被证实。1907年后的20年，人们才有可能认为蛋白质分子是有一定结构的，自然状态下的蛋白质和费歇尔在实验室里合成的蛋白质很不相同。1910年至1935年，来自几方面的研究成果，使人们逐渐接受了蛋白质是具有一定的原子组成和专一结构的大分子这样的观点。
其中一方面的研究工作主要是围绕蛋白质的物理性质——大小及形状——而进行的。费歇尔和他同时代的学者曾提出，分子量超过5000的蛋白质是不存在的。然而，1917年，丹麦化学家索伦·索伦森（1868～1939年）对蛋白质溶液进行了一系列的渗透压研究，索伦森根据研究结果断言，某些蛋白质（如蛋清清蛋白）的分子量大于34000（今天测得的值大约是45000）。1925年，瑞典物理化学家西奥多尔·斯维德伯格（1884～1971年），介绍了一种全新的技术，革新了确定生物大分子分子量的方法。他发展了一种称为超速离心机的仪器，当含有各种分子的溶液在里面以很高的速度旋转时，在一定的转速下，分子密度越大，沉淀的速度越快。通过对分子的大小和密度作出几种假定，斯维特伯格能够精确地计算出蛋白质分子的重量。他证明了，像血红蛋白这样的蛋白质，它的分子量大约在66000以上。今天，超速离心法仍被用作精确测定分子量的方法。由此证明蛋白质是很大的分子，比20世纪初人们所设想的要大得多。由于发现相同的蛋白质有同样的分子量，斯维德伯格进一步证明，蛋白质具有一定的大小和组成。
到20世纪20年代中期，胶体学派逐渐销声匿迹了。不过那些试图更精确地证明蛋白质分子有一定组成的人，仍然面临着许多棘手的问题。一是很难得到纯的蛋白质，即保证用于分析的样品只应含有一种蛋白质分子。另一个问题是充分地分离大蛋白质的降解产物（氨基酸的分离）有困难。第三个问题是还不能在实验室里合成含有所有氨基酸的多肽。1920～1950年，由于一系列研究的进展，才解决了其中的一些问题。
进展之一是结晶蛋白质技术的完善。詹姆斯·萨姆纳首先成功地作出了结晶体。1926年，他制出了脲酶（脲酶能把尿素转化为二氧化碳和氨）的结晶。1935年，美国化学家诺思洛普成功地得到另一种蛋白质——普通的胃蛋白酶（一种消化蛋白质的酶）的结晶。这就意味着可以得到蛋白质的纯品。这足以使化学家们最终信服萨姆纳是正确的，而维尔施泰特所作酶是非蛋白质的断言则是错误的。
另一个进展是德国化学家马克斯·伯格曼和利奥尼达斯·泽尔瓦斯进一步完善了多肽的合成法。1932年，他们发展了用各种氨基酸随意合成人工多肽的技术。他们工作的价值在于，通过使用这些技术，能够合成大小及形态更接近于天然蛋白质的多肽。在化学上合成某一物质的能力往往是一种有力的工具，如果有可能用实验技术合成一定的分子，那么就为分子的原子排列学说提供了强有力的证据。
第三方面的进展是层析技术的完备。此项技术是俄国化学家米契尔·塞门诺维奇·茨维特于1906年发明的。层析法是利用混合物溶液流经某种固体表面时各成分吸附在固体表面能力的不同从而将混合物分开的一种技术。例如，让一种具有不同染料的溶液，流过一长条有吸附能力的滤纸或注入装有树脂或淀粉的吸附柱时，由于每种染料的分子彼此不同，它们在溶液中的滞留性也各异，（当它们流过滤纸或通过吸附柱时）被吸附在固体物质上的情形也不同。因此，经过一段时间之后，染料中的所有同种分子将被吸附在滤纸或柱的同一位置上，（在这种情况下）就形成了一套不同颜色的染料带。20世纪40年代初，两位英国蛋白质化学家阿切尔·马丁和理查德·辛格看到了这种技术对分离蛋白质各种水解产物的价值，他们将层析法应用于由天然蛋白质水解产生的各种单一氨基酸、二肽、三肽等的均质混合物上。运用这种方法得到了惊人地精确和简明的结果。层析技术的主要优点在于，运用这种技术可以分离出任一蛋白质所含有的各种氨基酸，并有可能定量地分析这些氨基酸。
由于这些技术不断地得到改进，英国的一群化学家在弗雷德里克·桑格的领导下，于20世纪40年代中期搞清了一种蛋白质的完全而详细的氨基酸顺序。他们选择了胰岛素这种激素作为研究对象，一方面因为它普遍存在（所有哺乳动物都产生），另一方面也因为它比其他蛋白质小。桑格和他的小组用各种方法水解胰岛素，每种方法都得到了不同的水解产物。例如，用消化蛋白质的酶——胃蛋白酶，总是得到末端为某种氨基酸的片段；用胰蛋白酶，通常得到末端为另一种氨基酸的片段。反之，若用强酸处理，则各种末端氨基酸的片段是随机的。由此他们设想：①酸水解肽键是随机的；②消化蛋白质的酶是专一性的，只断裂某些氨基酸之间的肽键。桑格研究出了测定胰岛素中多肽链的氨基酸顺序的巧妙方法。关键的步骤是N端的标记和肽的酶解，他用二硝基氟苯标记N端。桑格和他的同事们一旦分离出各种片段，他们就能确定每个片段的化学特性，并确定它们的数量。用这种方法，他们鉴定了数百个片段并确定了每种片段出现的频率。最后，桑格不仅搞清了胰岛素中氨基酸的数目和种类，而且还揭示了它们彼此连接的特定顺序。20世纪40年代中期，桑格和他的小组已经描绘出一种胰岛素——牛胰岛素的氨基酸排列顺序图。这个胰岛素分子总共由51个氨基酸组成，排成两条多肽链，两条肽链之间由二硫键相连。桑格的工作第一次证明了蛋白质是氨基酸通过肽键连结在一起的聚合物。
经过多年的研究，桑格终于在1954年确定了胰岛素的全部结构式。这一重要发现不仅提供了有计划合成胰岛素的可能性，而且也指出了揭示其他蛋白质分子结构，进而合成其他蛋白质分子的途径。差不多与此同时，艾曼在1949年提出了类似的研究蛋白质结构的方法，将氨基酸残基逐步降解。他用苯异硫氰与蛋白质作用，与游离氨基生成硫脲的衍生物。然后在硝基甲烷中将这种衍生物与盐酸作用，这样，末端的氨基酸就会分解出去。稍后一些时候，人们又提出了确定蛋白质多肽链中氨基酸顺序的其他方法。其中比较有希望的是谢米亚金（1908～1970年）和科洛索夫、乌尔夫松一起提出的一种方法。这种方法采用质谱法（1968年）。
早在20世纪50年代，科学家们就试图合成胰岛素分子的各个片段，这种新奇方法是先把多肽链逐步接到载体上。把二硫链遵照严格规定的位置引入分子中遇到一些困难。美国化学家杜维尼奥用合成垂体后叶催产素的方法规定了将二硫键引入分子中的途径（1953年）。
1958年底，中国科学院生物化学研究所首先进行了天然胰岛素的拆合工作，即将胰岛素中三个硫硫键拆开后，再通过硫硫键的接合；使重新成为与天然胰岛素活力相同的分子。天然胰岛素拆合成功，把人工合成胰岛素的工作简化到先行分别合成二十一肽和三十肽。
1964年世界上共有三组科学家经过相当紧张的工作，各自独立地用人工方法合成了胰岛素。特别要提到我国化学家汪猷、邢其毅、邹承鲁、钮经义1965年夏在世界上首次用化学方法全合成具有生物活力的牛胰岛素。这一工作需要按严格顺序实现约220个反应，可见它是多么困难！瑞典乌普萨拉大学生物化学研究所所长、诺贝尔奖获得者蒂萨利乌斯说：“核能力说明了中国的进展，但更有说服力的是胰岛素。因为，人们可以在书本中学习制造原子弹，但不能在书本中学习制造胰岛素。”
早在20世纪50年代确定胰岛素结构和部分合成胰岛素获得成功，使得科学家们对研究其他蛋白质结构发生了很大的兴趣。其中核糖核酸酶引起了化学家们的注意，它与胰岛素不同，只含有一个链状结构。美国科学家海尔斯、斯坦与穆尔三人根据桑格和其他科学家的实验于1960年测定了核糖核酸酶的全部结构式。他们采用了一种叫做“氨基酸自动分析器”十分有效的新方法。这是斯坦、穆尔和斯佩克曼三位科学家不久以前研制成功的。
以后在20世纪60～70年代人们发现了其他蛋白质的结构式。在研究工作中应用鉴定氨基酸的最新方法和采用自动装置大大地减轻了并加速了操作过程。确定蛋白质结构以致合成蛋白质这样的事实，决不是表明人工合成“活”物质的问题差不多已经得到解决。然而，正如一位积极研究生物化学的科学家肯德鲁所说的：“生物化学这门科学现在发展得既深入又全面，毫无疑问，我们不久将在理解生物学中心问题之一，即构成活细胞分子的结构和它的生物学功能之间的相互关系方面取得进展。”
然而，桑格的工作只是确定了胰岛素的氨基酸顺序，而对于a链和b链的三维结构却没有提供任何线索：它们是长的、类似于梯子那样的，还是自行缠绕、折叠而呈球状。20世纪30～40年代由于两方面的研究而发展了蛋白质三维空间结构的观点。其一是林纳斯·鲍林有关蛋白质缠绕的理论工作。其二是马克斯·佩鲁茨和约翰·肯德鲁对某种蛋白质晶体的X射线衍射资料进行的试验和理论分析。
20世纪30年代中期，美国化学家林纳斯·鲍林根据他的通用化学键学说，发展了一个关于蛋白质结构的新观点。鲍林具有理论化学家的敏锐洞察力，他证明了像蛋白质这样的巨大分子之间起作用的化学键有多种类型。特别值得一提的是他创立了“弱相互作用”这种概念。认为原子和原子群之间的引力比所谓共价键的引力要弱。溶液的温度或酸度等因素的略微增高，不足以使肽键破裂，但已证明它们对蛋白质的某些物理、化学性质已有严重的影响。然而，只要变化不大，当回复到正常状态后，蛋白质的性质又可恢复正常。鲍林和他的同事米尔斯基在20世纪30年代中期就提出，蛋白质的氨基酸链不是一条简单的线形分子长链，而是以种种不同的方式自行折叠的。他们认为，这种折迭是精确地依靠氨基酸两侧的弱化学键来维持的，其中有一类称为氢键的弱的相互作用尤为重要。氨基酸链中最主要的一种几何构型α-螺旋就是由氢键维持的。α-螺旋是一种最常见的盘绕，形状颇似弹簧，造成α-螺旋折叠的关键是氢键。鲍林和米尔斯基的模型与通过加热和提高酸度使蛋白质变性和复性的化学研究资料非常相符，而且也符合于后来使用X射线衍射研究晶体蛋白质的数据。α-螺旋的概念有两重意义：①它为蛋白质有精确的三维结构提供了第一个清晰的证据；②它为蛋白质化学家提供了一种愈来愈有用的确定分子结构的方法——建立化学模型。由于鲍林的研究，到20世纪40年代初，已经确认了蛋白质具有三维结构，这种三维结构在决定蛋白质的功能上，与氨基酸的特定排列顺序一样重要。显然，每种蛋白质都有一定的分子构型，这时，胶体学派的观点对化学家和生化学家已经没有什么影响了。
二、核酸化学的兴起
核酸是另一种重要的生命物质，它的发现比蛋白质约晚30年。