细胞工程是以细胞为基本单位,在离体条件下,进行培养、繁殖,有计划地改进细胞的遗传基础,改良和培育新个体的技术。它包括组织培养、细胞杂交、花药培养、胚胎培养和试管受精等技术。以下仅就前三项作扼要介绍。
一、组织培养技术
组织培养(tissueculture)是利用植物组织和器官,通过无菌操作接种于人工配制的培养基上,经过人工诱导增殖,产生完整植株的过程,也称微体繁殖(micropropagation)。
作物的组织培养,首先根据作物特性,选择繁殖的材料,包括根部、茎尖、腋芽、花芽、胚轴和胚等组织。其次建立无菌培养基,一般常用的有MS、ER、B5和N6等培养基,控制适当的温度和光照,培养产生再生苗,当苗长3~4片真叶时,移入温室锻炼,再移出室外,用玻璃罩或薄膜覆盖,保湿保栽保活。
二、花药培养技术
花药培养是细胞工程中的重要内容。它是将植物花药中的花粉粒培养成完整的个体的技术。这种技术对于远缘杂交以及控制杂种分离有着特殊的利用价值。一般经过以下步骤:花粉在培养基上诱导产生胚状体,胚状体分化成各器官的原体和芽点,再生长发育成植株。技术关键在于配制适宜的培养基。从花粉到成株都在培养基上分化生长,培养基的成分和状态,对于形成能独立生存和繁殖的个体至为重要。
(一)培养基
培养基的配制方法和种类很多。不同作物,不同要求应试验和选用适宜的培养基。首先确定基本的培养基,而后选择激素的种类和浓度,蔗糖的浓度以及天然复合物的采用,以保证诱导花粉小孢子分裂分化。根据试验和应用结果,介绍几种培养基作为选择试验的参考。N6培养基适用于粳稻。M8培养基适用于籼稻。NitschH培养基适用于烟草。MS培养基适合于棉花及多年生植物。其他尚有Millor和B5等可以应用。以上培养基可在试验中适当增减某些成分,以增进培养效果。
(二)花药培养方法
在田间选取中晚期的花药,经过灭菌、低温等预处理,将花药散落于盛在小烧杯的液体培养基中,挤出花粉,经网筛过滤,低速离心,除去残渣,使悬浮液平铺在培养皿,并用封口膜密封培养皿,以免蒸发脱水,再置于适当温度(26~30℃)和红的荧光灯、低强度的白炽灯或黑暗条件下培养。这样培养3~4周后,生出愈伤组织,再将其移植到芽分化的和生根的培养基中,待生出正常根茎叶后,除去封口膜,锻炼1~2d,将小植株移于盆中。
三、体细胞杂交技术
体细胞杂交(somaticcellhybridization)是指不同体细胞的原生质体融合一起的过程,也称细胞融合(cellfusion)。这种技术可克服育种工作中杂交不亲和性及转移雄性不育基因,培育新种、新品种等。成为作物育种的一个重要手段。体细胞杂交一般经过原生质体融合、杂种细胞选择和杂种植株再生和鉴定。
(一)原生质体融合
原生质体是细胞壁(膜)以内的半透明的胶体物质,包括细胞质和细胞核,是细胞新陈代谢和分裂繁殖的物质基础。原生质体融合可以把不同作物的细胞结合起来,综合不同的遗传物质。原生质体融合按性质可分化学融合和物理融合,以下列举聚乙二醇融合和电融合加以说明。
聚乙二醇(PEG)是一种化学多聚物,可作为原生质体融合剂。由于其中醚键的存在,在分子的末端带有弱电荷,其溶液处理混合的异源原生质体使之黏着而融合,如果再结合高钙(Ca2 )和高pH值处理,诱导融合率显著提高,成为较为先进的体细胞杂交技术。
电融合是使原生质体的悬浮融合液,在两电极间施加高频交流电场,原生质体偶化极化,则沿两电极线方向泳动,并相互吸收而形成与电场线平行的原生质体链。以后再用一次或多次瞬间高压直流电脉冲,以引发质膜的可逆性破裂,促使原生质体的融合而形成杂交融合体。
(二)杂种细胞选择
在PEG溶液中,进行不同作物的异源原生质体的融合,其中除了杂种细胞外,尚有未融合的原生质体,如何把杂种细胞选择出来呢?一种方法是物理方法,根据原生质漂浮而采用离心沉淀异核体;根据细胞的颜色差异,在显微镜下,将融合细胞分离。另一种方法是代谢互补选择,用不同的生化抑制剂分别处理不同的原生质体,阻断它们的代谢途径,使它们在培养基内生长不同,以达到选择的目的。其它尚有同工酶分析,DNA印迹法和随机扩增多态性DNA分析(RADD)等方法,用作不同融合体选择。
(三)杂种植株再生和鉴定
细胞杂交完成异源原生质体融合后,进而发育成完整的杂种植株,从中选出新品种才能达到最终目的。根据不同作物和实际情况,制备适宜的培养基,在适当的条件下,培育试管苗,进行营养钵假植锻炼,带钵带土移栽,确保成活。杂种植株生长期间,可按常规杂交育种技术的田间试验程序和方法,观察鉴定,选出理想个体,进行繁殖比较,育成体细胞杂交新品种。1971年,我国首次从烟草叶片原生质体培养出完成整植株。1972年培养出粉蓝烟草(N.glauca)和蓝格斯多夫烟草(N.langsdorffii)种间体细胞杂交植株,取得重大突破。