随后，伦琴继续进行他对电流的研究，这次他的研究对象是阴极射线。
这个时候，荷兰的洛林兹教授——伦琴电流的命名者，已经证明了阴极射线是电子流动的现象。
什么叫电子呢？
世界上的一切物质都是由分子构成的，分子是代表该物质性质的最小单位；分子进一步分为若干个原子，原子又是由一个带正电荷的原子核和若干带负电荷的电子组成的。所以，电子是组成原子的一种基本粒子。
合吐路夫管里流动着的东西，就是这种构成原子的基本粒子。这个粒子碰撞在管壁上，就会发出荧光，人们才能看见蓝白色的颜色。此外，它还发出了一种肉眼看不见的光线，它能使感光板感光，在伦琴发现它之前，人们还不知道它的存在。
1895年11月8日，一个星期五的傍晚，深秋的寒风吹得树叶瑟瑟作响。
维尔茨堡大学物理研究所实验室的一个房间亮着灯。这是物理所的所长伦琴先生在进行实验。
老师、助手和学生们早已走光了，整个楼里没有一点点声音，只有年过五十的伦琴一个人静静地坐在实验台前。他根本没有料到，就在这一天，这样一个夜里，他即将做出一个重大发现——他只是像以前的无数个日子一样，孜孜不倦地进行着研究工作。
桌子上摆放着一排排各种各样的仪器、用具。伦琴正在摆弄一台真空放电器，这就是克鲁克斯和合吐路夫两个人都曾研究过的那种特殊的玻璃管的改进装置。他在全部由玻璃做成的合吐路夫管的两端，接上有水银断继器的感应线圈，然后再接上高压电，于是便听到了“啪、啪”的响声，蓝白色的光线也开始在玻璃管里流动。
“阴极射线出来啦。”
伦琴一只眼睛的视力已经大大减弱了，但是他还是目不转睛地盯着那放电装置。过了一会儿，他稍微动了动射体，忽然，他隐约感到射线管附近的一块氰亚铂酸钡屏幕上透出了一点荧光。因为要观看放电情况，屋子里的灯开得的较暗，所以他能看到那很微弱的光。
“这是怎么回事？”
按理说阴极射线是不能通过玻璃管壁的，它所放出的光也不可能从合吐路夫管里跑出来，那荧光屏上反射的是哪儿来的光呢？
为了再看看清楚，伦琴把所有的灯都关掉了，屋子里全暗了下来。
“啊！”这一回荧光屏上的光更清晰了，伦琴不知不觉喊出了声。“难道我设计的装置不够严密？”
这回他放下了窗帘，然后又用黑纸一层一层地把合吐路夫管紧紧地给包上。屋子黑漆漆的。“这回应该不会有光了吧？”
摸索着结合吐路夫管通上电。阴极射线的蓝白色光线，完全被黑纸挡住了，一点儿也看不见。可是离放电器两米远的荧光板却依然发着光。停止结合吐路夫管供电时，荧光板上的光线就消失了。这不会错的，一定是有一种肉眼看不到的东西从合吐路夫管里跑出来，使荧光屏发光的！
谨慎的伦琴压抑住内心的激动，继续进行实验。他又卷了厚厚的十张黑纸，仔细地把合吐路夫管再包起来，反复供电断电，荧光屏也时明时灭；把铝板夹在合吐路夫管和荧光屏之间，荧光屏继续发光；把书本、木头、玻璃等等他手边能拿到的一切东西都试了一遍，荧光屏依然亮着。只有当他把沉重的铅板档隔在中间时，荧光屏才不亮了。
“真是太奇妙了！”
从来不疏忽的伦琴认定这一次的发现是很了不起的。通过一次又一次的试验，他慢慢认识到这个未知的光线，容易透过密度小的物质，如纸、木头、铝等；而阻隔物的密度越大，光线就越容易被其吸收，透不过去。
伦琴提心吊胆地把自己的手搁进去。
“啊呀，显示的是骨骼！”
在荧光屏上模模糊糊地映上了一只可怕的手骨。手的轮廓也隐约可见。
这个未知的光线几乎全部透过了肌肉部分，有骨骼的地方却被挡住了，所以显示在荧光屏上，骨骼的部分成为深深的影子。伦琴激动紧张得汗流满面。从事物理学的研究、实验将近40年了，他从来没有像今天这样惶恐不安过。
伦琴逐渐地冷静下来，摸着胡须在实验室里踱来踱去。
“我已经可以肯定人类还没有发现过它！那么，就把它做X光吧！”
在数学里，习惯上把未知数称为X。因为这是新发现的、尚未弄清楚其性质的光线，所以伦琴叫它X光。
考虑到对新发现的X光还不了解，伦琴没有对任何人讲这件事，他只是比以前更加勤奋地进行实验，甚至达到了夜以继日的程度，连家也不怎么回了。他要尽快地了解它，掌握它。
从11月到12月间，天气逐渐冷起来了。但是伦琴教授依然整日关在实验室里埋头研究，并且干脆搬了张床放在研究室里。同事、学生们都非常奇怪：教授这是怎么了？
伦琴不顾别人有什么看法，整整7个星期，他仿佛生活在一个独立的世界里，几乎是奋不顾身地忘我地研究着X射线。
他首先弄清楚了一点：X射线是阴极射线碰到金属板时发出的。
随后，伦琴重点研究了这个神秘光线的穿透性，身边的所有东西被他试了一遍又一遍。最后，伦琴想利用X光线拍照。在用纸包着的合吐路夫管发出的阴极射线旁边，放上一张感光板，通电之后发现整张感光板都被感光了。
这使伦琴弄清了X射线和普通光线一样，能够使感光板感光。他进一步推进自己的实验：把砝码放在木箱里，木箱后面摆好感光板，然后在前面对木箱用X光照射，把感光板显影后，发现砝码的黑影被清清楚楚地照了下来。
看来X射线可以透过一个物体照到另一个物体上。伦琴还给屋门拍了一张X光的照片，结果是发现了一个模糊不清的影子。他当即叫人拆开了大门，找到了一个金属片，伦琴这才心满意足！
伦琴这样没日没夜的工作不仅令学生和助手们感到费解，也使夫人别鲁塔深感不安。她不知道几个星期以来很少回家，即使回到家也是一副若有所思模样的丈夫是不是遇到了什么麻烦事，同时她也很为他的健康担心。
这一天，伦琴又没有回家。这已经是12月22日了，即圣诞节的前夕，别鲁塔夫人十分生气，决定亲自去看一看丈夫究竟在干什么。
她看到实验室里的伦琴完全不像在家里面的样子而是兴高采烈的。见到夫人光临，伦琴有些吃惊，但还是很高兴。他知道夫人是来兴师问罪的，便先说道：“别鲁塔，过来看看我的伟大发现。”
他让夫人把手搁在照相底片上，给她拍了张X射线照片，这也是X射线照出的人类手的第一张照片，它也成为历史上最著名的一张照片。伦琴亲自在照相底片上用钢笔写上了1895年12月22日。
显影以后，别鲁塔看到了自己手的骨骼，惊叹不已：真是太伟大了！这个圆环是什么呢？
“你手指上戴的结婚戒指呀！”
夫妇两人相视而笑。
接着，在别鲁塔的支持下，伦琴放弃了圣诞节，写成了第一篇关于X射线的报告。这篇报告以《关于一种新的光线》为题，用严密的文笔，把他历时7个星期的研究成果，写成了16个专题。
举世瞩目的成就
伦琴的发现一经公开，立即引起了世界性的强烈反响。
首先，在科学界立刻形成了一股“X射线热”。几乎欧洲所有的实验室都开始用合吐路夫管来进行试验，拍照；一夜之间就冒出了数以百计的X射线专家，报刊上也塞满了各种X射线的照片，如头骨、手骨、脚骨照片等；“X射线和医学”、“X射线和政治”等等文章充斥了所有的报纸。
伦琴也获得了前所未有的荣誉。1896年1月23日，德国皇帝威廉一世召见了伦琴，并授予他皇家伦福奖金。伦琴在领奖时的发言中说道：“我今日的这份荣誉应归功于在天的孔脱教授。当年是他始终鼓励我，即使我错了，他也教我不要泄气。