机制研究进展
结核分枝杆菌耐药性是指在内因、外因的共同作用下，结核分枝杆菌对于原来敏感的药物出现的表型或遗传型敏感性下降的现象。结核分枝杆菌是耐药性问题最为突出的少数几种病原菌之一。细菌对抗生素产生耐药的机制，大致有三种类型：
一是膜通透性有关的转运诱导适应型。细胞膜或细胞壁结构与组成发生变化，使菌细胞膜通透性改变，药物通透性降低，菌细胞摄入药物量减少。
二是耐药因子（质粒或转座子）介导的药物失活型。耐药基因存在于染色体外的质粒或转座子中，其编码合成各种抗生素的灭活酶，将抗生素灭活而失效。通过耐药因子的传递，使敏感菌株转变为耐药菌株，最终导致耐药性产生是细菌常见的现象。分枝杆菌属的某些非结核分枝杆菌（如鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等）也含有耐药性质粒。
三是药物靶位改变型。细菌染色体的环形DNA上有控制药物敏感性的遗传基因。由于自然突变，可能使药物敏感性的遗传基因编码的蛋白质出现异常，这些蛋白质往往是药物作用的靶位，导致原来对药物敏感的细菌变成耐药。
近10多年来，国内外学者对结核分枝杆菌耐药机制进行了深入研究，取得了明显进展。目前研究显示，结核杆菌耐药性的产生主要是结核杆菌染色体上药靶基因突变所致，即染色体基因变异是结核菌产生耐药性的主要机制。结核杆菌的自然耐药突变率在10-5～l0-10之间。和其他细菌一样，在一个菌群中，耐药个体的出现是以一定的频率产生，并因药物对敏感菌体杀灭的选择性作用，耐药菌体比例逐渐增加，直至使耐药菌成为优势菌群。目前已发现结核杆菌染色体上l0多种基因由于结构或表达水平的改变导致对药物产生耐药性。主要由于基因改变引起耐药性的抗结核药包括利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）、吡嗪酰胺（PZA）、氟喹诺酮类（FQ）等所有一线抗结核药物和主要的二线药物（见表1-3）。
耐利福平与rpoB基因突变
利福平（rifampin，RFP）是一种快速全效杀菌剂，为重要的一线抗结核药物，是当前短程抗结核化疗的基础。早在1959年，即从Strepbmyces mediterranei的培养液中得到多种成分的抗生素利福霉素（A－E），通过化学改造，1965年从其衍生物中合成了利福平，属半合成抗生素。作为亲脂性抗生素，RFP能迅速透过疏水性的细菌胞膜，与结核杆菌的RNA聚合酶β亚单位以非共价键结合，抑制该酶的活性，在转录水平上发挥抗菌作用。
当前，对结核分枝杆菌利福平耐药机制的研究是建立在对大肠杆菌依赖DNA的RNA聚合酶的研究之上。RNA聚合酶是由4个不同的亚单位（α、β、β′、δ）组合而成的单链复合体。四条链组成的核心酶（α2ββ′）具有聚合酶活性，并和另一个能特异启动转录的δ因子一起即组成全酶（α2ββ′δ）。编码α、β、β′和δ亚单位的基因分别称为rpoA、rpoB、rpoC和rpoD。1983年，Wehrli进行了聚合酶亚单位重组试验，结果表明：含αβ′亚单位的利福平耐药菌株和含β亚单位的利福平敏感菌株的聚合酶对利福平敏感；含αβ′亚单位的利福平敏感菌株和含β亚单位的利福平耐药菌株的聚合酶对利福平耐药。因此，只有β亚单位与RNA聚合酶对利福平的耐药性相关。同时，也进一步说明了RNA聚合酶的β亚单位为利福平的靶位点，利福平是通过结合于RNA聚合酶的β亚单位上，导致结核杆菌转录时RNA合成起始受阻，抑制了菌蛋白合成，从而表现为抑菌效应。编码β亚单位的基因rpoB即为靶编码基因。
1985年，Yamada等进一步揭示结核杆菌RFP耐药株的依赖DNA的RNA聚合酶发生了改变，使得药物不能与之结合，从而导致RFP丧失抗菌作用。
1988年，Jin和Gross分离到42株自发性产生的大肠杆菌RFP耐药株，序列分析显示大肠杆菌RFP耐药株的β亚单位结构基因rpoB出现17种突变，涉及到14种氨基酸改变。为了验证所检测的突变与RFP相关，运用等位基因交换技术，将相应rpoB突变基因转入pBR322质粒，并可使敏感的大肠杆菌发生耐药性表型的改变。
1993年，Telenti等首先应用PCR扩增了结核杆菌一个411bp片段，对应于结核杆菌380位到516位氨基酸（相当于大肠杆菌的455位到591位氨基酸），结果66株RFP耐药株中64株基因突变，2株RFP耐药株未检出突变，56株RFP敏感株均未检出基因突变，耐药株的突变共有15种，涉及8种氨基酸。
1994年，Mi11er等将结核杆菌敏感株rpoB基因引入穿梭载体pMV261，并电穿孔转化到高耐药耻垢分枝杆菌菌株LR223，可降低耐药株耐药水平；进一步应用PCR诱变技术造成结核杆菌rpoB456位氨基酸（相当于大肠杆菌的531位氨基酸）突变，并电穿孔转化到敏感型耻垢分枝杆菌菌株LR222，则使之发生耐药表型改变，由RFP敏感株转变为耐药株。证实了rpoB是造成RFP耐药的原因。
近几年从结构生物学方面对RFP耐药的机制进行了研究，Campbell等（2001年）对嗜热菌RNA聚合酶核心区和RFP的复合体结晶进行分析，结果显示RFP可以和位于DNA/RNA与通道深处的RNA聚合酶β亚单位的一个距酶活性中心12的带状结构相结合，因而在RNA转录合成2～3个核苷酸长度时即可直接阻止RNA链的延伸。
虽然，目前已把rpoB突变作为结核杆菌耐RFP的遗传标志，但rpoB突变并不能完全解释结核杆菌对RFP产生耐药性的分子机制。例如，尚有5%左右的耐RFP结核杆菌未能在rpoB突变热点区检出突变；已检测出的rpoB基因突变多达20余种，这些突变是否均能改变RNA聚合酶空间构象，继而导致耐药性还未能完全阐明；特别是与结核杆菌同属的鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和耻垢分枝杆菌对RFP的耐药性与rpoB基因并无关联，提示还可能存在尚未发现的RFP耐药机制。
可能存在结核杆菌耐RFP机制包括：在rpoB核心突变区之外的位置发生突变，在大肠杆菌的RFP耐药的研究中即发现rpoB核心突变区之外的位置发生突变；RNA聚合酶其他亚基的突变；影响RFP渗透性的细菌胞膜改变等等。因此有关结核杆菌RFP耐药机制的研究还有待于进一步加深。
耐异烟肼与katG、inhA和ahpC基因突变
异烟肼（Isoniazid，INH）为最早合成的抗结核药，和RFP一样，是重要的一线抗结核药物。1952年，发现异烟肼具有强大的抗结核作用，至今仍是现有抗结核药物中抑菌作用最强的药物，这被认为是结核病治疗史上的一个里程碑。INH结构简单，仅由一个吡啶环和一个酰肼基团组成。目前各地报道的INH耐药率也呈上升趋势，然而其耐药机制却是所有抗菌药物中最为复杂的一个，至今尚未完全阐明清楚。
INH是前体药物，需要细菌通过体内代谢使其活化。细菌体内的过氧化氢－过氧化物酶不仅有助于促进INH进入菌体，而且还可以对INH加以化学修饰，使之具有生物活性，从而产生杀菌效应。早在20世纪50年代，就发现了INH耐药结核杆菌中过氧化氢－过氧化物酶活性丧失或降低的现象。以后许多学者对该酶与INH耐药性的关系进行了大量研究。直到1992年，Zhang等克隆出过氧化氢－过氧化物酶编码基因（katG），并将这个基因转移到耐异烟肼的耻垢分支杆菌中，可以恢复该菌对INH敏感性，从而证实了katG基因与INH耐药性之间的关系。katG基因的结构已经清楚，其处于上游furA基因和下游embC基因的一个功能区段。全长2223bp，G＋C含量为64.6％。katG基因编码含血红素酶，即过氧化氢酶－过氧化物酶。其N端编码作用范围广的过氧化物酶，C端编码过氧化氢酶。此酶在细菌的氧化应激反应中起作用，广泛存在细菌中。很多细菌含有katG基因，与分枝杆菌katG基因有较高的同源性。在结核杆菌中，katG基因编码的过氧化氢酶－过氧化物酶能转化异烟肼成为毒性形式，这种活化的INH形式能与分枝杆菌分枝菌酸生化合成途径中的编码烯脂酰载体蛋白（enoyl－ACP）还原酶－NADH复合体结合，抑制其活性，进而干扰分枝菌酸合成，发挥抗菌作用。katG基因突变后，过氧化氢酶－过氧化物酶空间构型改变，活性降低或丧失，与异烟肼结合能力下降，阻止INH转换成活性形式，进而导致耐药性表型。
目前，国内外通过PCR-SSCP和基因测序等分子生物学技术对大量临床菌株的katG进行了分析。结果表明，主要是katG基因的点突变与INH的耐药相关，其中katG315位突变与INH耐药的相关性最为明确，在异烟肼耐药结核分枝杆菌临床分离株中，50%～70%出现点突变或部分缺失、插入等，最常见的点突变是315位Ser（AGC）Thr（ACC），315位Ser被视为是决定酶活性的关键部位。其他还可见katG基因63位Asp、108位His、104位Arg、108位His、138位Asn、148Leu、262位Thr、270位His、275位Thr、312位Trp、350位Ala、381位Asp和629位Gly等密码子突变。目前也有报道指出，katG的一些突变不影响酶的活性。例如，先前一些文献都集中对katG基因中315Ser和463位Arg突变作了报道，认为这两种突变和耐药性关系最密切。但近年来一些学者认为463位Arg不影响酶活性，生化和流行病学资料也证实463位ArgLeu的突变与INH耐药无关。
INH耐药性相关的另一个基因是inhA基因，由Banerjee等于1994年首先克隆出来。inhA基因全长810bp，编码enoyl－ACP还原酶，其上游是mabA基因，二者相距21bp，inhA和mabA基因共同组成一个操纵子，转录起始于mabA基因上游的启动子。inhA基因参与结核杆菌分枝菌酸的合成，编码产物是enoyl－ACP还原酶（InhA）。该酶在脂肪酸合成循环反应的最后一步起作用，将不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸，参与长链脂肪酸的延长，并进一步被分枝杆菌用于合成分枝菌酸，分枝菌酸是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是一种长链且带侧枝的脂肪酸（60～90个碳原子，能维持细菌菌体的完整性）。INH通过抑制分枝菌酸的生物合成会引起一系列反应而导致细菌变形、分解并死亡。Rozwarski等（1998年）研究证实InhA是活化的INH的原始靶位，INH特异地结合于InhA的辅助因子（NADH还原型辅酶Ⅰ），形成加和物，此加和物可共价结合于InhA的NADH结合位点，灭活InhA，产生杀菌作用。一旦inhA突变，InhA结构改变，导致InhA对NADH亲和力下降，即使异烟酰-NADH复合物已经形成，也难以影响InhA的酶活性，从而形成对异烟肼的耐药。一些研究者报道了临床菌株中inhA的突变情况，但结果不尽一致。Basso等对异烟肼耐药菌株inhA进行了测序，发现5株inhA结构基因存在下列突变：Ile16Thr（ATC→ACC），I1e21Val（ATC→GTC），Ile47Thr（ATT→ACT），Val78Ala（GTG→GCG）和Ile95Pro（ATT→CCT），且不伴其他突变。在异烟肼敏感菌株中未发现这些氨基酸替换。但更多的研究报道显示，结核杆菌多为启动子区发生突变，突变率在10％左右，突变发生在位于mabA起始密码子上游的核糖体识别结合位点（RBS），突变造成转录上调，通过使InhA蛋白过量表达，造成细胞内InhA浓度增高，来抵抗INH的选择压力，导致耐药产生。