进入20世纪后，微生物学获得了空前的发展，研究重点也逐渐转移到了生化水平及分子生物学的水平上。自从德国学者布希纳（E.Buchner，1860—1917年）发现了酒化酶之后，微生物的发展就深入到了生化水平。1901年德国人瓦尔德斯（E.Wildiers）发现酵母菌酵母菌不能合成对其自身生长所需的全部成分，需要外界加入称为“Bios”（即VB1复合物）的生长因子，同时还发现在麦芽中存在这种可透析的、耐热的“Bios”。1904年英国人哈登（A.Harden）和永（W.J.Yong）等又发现酵母菌榨取汁经透析后会失去其发酵活性，从而证明了辅酶的存在，同时他们还发现磷酸盐能促进酵母菌榨取汁的酒精发酵过程，并从中分离出有机磷酸化合物。
在20世纪20年代初期，剑桥大学的斯蒂芬森和夸斯特尔（J.H.Quastel）对细菌酶是脱氢酶进行了研究，他们利用通伯技术（在装有给氢体、细菌悬液和美蓝的排气管中测定美蓝脱色的时间）对多种细菌的脱氢酶进行了一次系统的研究，在当时关于细菌合成代谢的知识极少或根本没有，所以斯蒂芬森他们的研究工作具有极大的引导意义。但关于由分解代谢途径产生的能量怎样贮藏及转变为动能问题，仍然未能解决。1930年，卡斯特隆（Karstrom）第一次把细菌中的酶划分为组成酶和适应酶，适应酶在细胞中检测不到或者是以很低的浓度存在，但当把他们的作用底物加入到培养基中时这些酶的含量就会在很短时间内，并且在细胞不增殖的情况下明显的增加。
在20世纪初，由于微生物的拮抗现象大量存在已经被证明，并且证实在某些情况下，这种作用是由会扩散的抗生物质引起的。于是各式各样的青霉素菌株和铜绿假单胞菌成了学者们争相研究的对象，并对它们用于治疗疾病的可能性进行了评价。在这种热潮的推动下，1928年，英国微生物家弗莱明（A.Flemming）在研究葡萄球菌的菌落形态时，金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落平板偶然被污染了点青霉，随后发现其菌落周围葡萄球菌的菌落显示出溶解的迹象。经过一系列的实验，他从培养物的滤液中提炼出这种可以溶解葡萄球菌的抗菌物质，并把它叫做青霉素，但当时这种青霉素并不能被推广应用。直至1940年牛津大学病理学教授福楼雷（Howard Florey）提取和精制出了可用于人体肌肉注射的青霉素药品，青霉素才得以推广应用。
青霉素的发现重新引起了人们对土壤微生物可以产生抗生素这一现象的兴趣。1944年，俄裔美国人瓦克斯曼瓦克斯曼画像（S.A.Waksman）分离出第二种实用的抗生素——链霉素，链霉素的发现可以说是对青霉素的一种理想补充，因为青霉素只能作用于革兰氏阳性菌，即能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌，而链霉素则可以作用于革兰氏阴性菌（不能被革兰氏染色的细菌）以及使用青霉素无效的分枝杆菌，这样两种抗生素彼此代替使用便可以对付各种细菌。20世纪40年代中期以后，人们从放线菌、细菌和真菌中已先后提取了5500种以上的抗生素，其中有4000多种为放线菌产生，其余为细菌和真菌所产生，但临床上应用的不过100多种，人类最常用的也只有几十种。至今人们仍在继续寻找新的抗生素，新的化合物也在不断的涌现，这种状况就好像细菌和微生物学家之间的赛跑。细菌不断地产生对那些常用抗生素有抗药性的突变菌株，而微生物学家则在百折不挠地寻找细菌还没有来得及形成抗药性的新化合物。
进入20世纪40年代后，人们开始对微生物的变异产生了新的兴趣，临床中抗生素的使用很快导致出现了对这些药剂有抗性的菌株的出现，即抗药性菌株的出现，并随之带来了临床治疗问题。这是一类显然具有临床意义的细菌变异，全世界的医学细菌学家都把他们的注意力转向阐明这种变异的机理。而几个重大发现正是在这个契机之下发生的。
1941年，美国的比德尔比德尔（G.W.Beadle）和泰特姆泰特姆（E.L.Tatum）用粗糙脉孢霉代替高等植物或昆虫作为研究材料，用X射线诱变筛选获得了大量的营养缺陷型突变菌株（营养缺陷型是指某菌株经突变后，丧失了合成某种营养素的功能，若在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长。），这些突变菌株均不能在基本培养基上生长，需要添加相应的生长因素才可以生长。于是，在大量分析比较的基础上他们提出了“一个基因一个酶”的假说，这个假说为以后的研究所证实。比德尔和泰特姆的创造性发现为生化遗传学的发展奠定了基础，他们首先把遗传基因的功能与酶或蛋白质联系起来，微生物营养缺陷突变型的发现也为进一步深入研究基因结构、调控、重组以及生物的形态分化和发育等创造了条件。
1943年，意大利遗传学家卢里亚（S.E.Luria）和天体物理学家德尔布鲁克（M.Delbruck）进行了著名的波动性试验，其结果证明细菌对噬菌体产生的抗性是细菌的基因自发突变所致，与它们是否同噬菌体接触无关。他们的研究结果随后又被美国人莱德伯格莱德伯格（Lederberg）于1952年的影印培养法（一种通过盖章的方式达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同的遗传型菌落的接种和培养方法。）进一步证实，细菌的基因突变发生在它们与噬菌体或药物接触之前，影印培养法仅作为一种筛选手段，将自发产生的抗性突变从大量的突变中筛选出来。1944年，纽约洛克菲勒研究所细菌学家奥斯瓦尔多·艾瑞（Oswald Avery），麦克劳德（C.M.Macleod）和麦卡蒂（M.Mc Carty）在深入研究细菌转化过程中，发现遗传物质的化学本质就是DNA。这是一个革命性的发现，因为在这之前，一直认为遗传物质是蛋白质，而这个发现彻底否定了这一看法，将科学家的视线从蛋白质转移到了DNA这一真正的遗传物质上来。1946年，莱德伯格和泰特姆（E.L.Tatum）又发现了一种与转化作用不同的细菌基因重组方式——接合作用（雌雄细菌在菌体表面一部分结合，雄菌的遗传物质向雌菌内传递的现象），以后又发现基因的连锁现象，至20世纪50年代初，又发现F因子这种细菌质粒。