巴斯德和助手们如获至宝，开始进一步验证这一发现，结果正如他们设想的一样，这是防止鸡霍乱的一种十分有效的方法。鸡霍乱病菌在空气的作用下几周就可以达到减毒的效果，可炭疽病菌却不同，空气对其不起作用，在自然状态下炭疽病芽孢可以长期保持其毒力，八年十年甚至十几年后。因此他们开始尝试在芽孢形成前，对丝状菌进行处理。连续几星期不分昼夜地摸索后，终于发现炭疽病菌在42℃～45℃之间时，很容易培养却不产生芽孢，也出现了很好的减毒效果，原来能将10头绵羊致死的培养液，8天后只能毒死四五头。而过了10天或12天以后，则一头也不能致死了，只能使之得轻微的疾病，恢复后便获得了预防炭疽病的能力。炭疽病有了可靠的预防措施，巴斯德成功了！
朋友们为他庆贺，牧民们看到了希望，可反对者却对此大肆攻击，他们不相信多少年来兽医们毫无办法的可怕的顽症竟会在巴斯德面前束手就擒。
《兽医新闻》的编者罗西尼奥先生为大规模验证这一发现发起募捐。他说如果巴斯德成功了，会给畜牧业带来很大的利益，如果失败了，巴斯德只好从此闭口。他将这项实验方案提交给默伦农学会，学会主席罗歇特男爵便邀请巴斯德去默伦等地组织炭疽病预防接种的公开实验。
这是一项极为冒险的行动，成功了当然会引起极大的反响，可一旦失败，巴斯德将身败名裂，给对手以最好的攻击口实。好心人劝他：“你一定记得有人评价拿破仑的话：‘他喜欢威武雄壮、鲁莽大胆地进行危险的游戏。’他那时是孤注一掷，而你现在也是这样！”
这是一项破釜沉舟的计划。实验在默伦附近的普伊福特农场进行，默伦农协会给巴斯德提供了50只羊。罗西尼奥不知出于什么目的把计划印制了许多份，向全国农业界分发，于是默伦很快成了全国瞩目的中心。
实验计划将其中的25只羊用减毒菌苗预防接种两次，两次间隔12～15天，几天后，50只羊将全部接种上强毒力的炭疽病菌。“未接种过疫苗的25只将全部死去，接种过的将全部存活下来。接着，将死羊埋在一起用篱笆围起，第二年在里面关上一些羊，羊会因吃了带有蚯蚓翻上来的病菌的草而致病死亡。”
《兽医新闻》上发表了一条编者按语：“这些实验非常严肃。如果试验能像巴斯德先生满怀信心地宣称的那样，证实他所制定的一切，这些实验就非常值得纪念。
1882年5月5日，人们涌向实验场，这里有农艺师、医师、药剂师、兽医师、记者，还有一些牧民，他们怀着各种各样的心情要看个究竟。
巴斯德领着助手们来了。他迈着微跛的脚步穿过人群，全不顾众人的怀疑和窃窃私语，信心十足地动起手来。很快为25只羊注射了减毒菌苗，并在它们的耳朵上做好了记号。然后，巴斯德做了一次学术报告，他用清晰而简洁的语言，有条有理地叙述了自己走过的道路及他要达到的目标。讲话不时被反对意见所打断，而巴斯德对听众的无知和偏见一点也不感到惊讶，他深知有些人巴不得他一败涂地，而绝大部分的人却对他的成果一无所知。
5月17日第二次接种了减毒菌苗。
第三次接种的日子一天天临近，这是决定性的一步。一些好心人谨慎地劝他：“再等一等吧。”而他的对手也在做着准备，科兰在路上遇见了兽医师毕奥，便对他说：细菌培养液分两层，上层没活性，下层活力很大，巴斯德一定用上层液体给种过疫苗的绵羊接种，你一定要在最后一刻抓起细菌培养液的瓶子猛烈摇动。
5月31日，大家来到农场，毕奥按科兰所说，使劲摇动瓶子，并要求巴斯德注射比定量多的毒液。还有人提出将毒液在种过疫苗和没种过疫苗的羊中交替注射，巴斯德对这些要求不动声色地一一照办，丝毫不追究其动机。
人们急切地等待着，无论是想为这样一次伟大的科学实验的胜利而举杯欢呼的人，还是希望为巴斯德的惨败而弹冠相庆的人，都在焦急地盼望着最后时刻的到来。
巴斯德更是焦虑不安。第二天，他们回到农场查看情况，发现未接种过疫苗的羊有几只已表现出了病症，可接种过的羊也有几只体温明显增高达到了40℃。巴斯德为羊的体温上升而十分担忧。
但很快，接种过疫苗的羊恢复了过来，而没接种过的则开始一只只地死亡。
6月2日下午2点，巴斯德在助手们的陪同下，来到了普伊福特农场的空地上。这次没有不负责任的冷嘲热讽，也没有漫不经心的窃窃私语，在场的人都热烈地鼓掌向巴斯德表示庆贺，因为未接种疫苗的25只羊中有22只的尸体挨着摆放在地上，有2只正在咽气，另1只也表现出明显的病症，而接种过疫苗的25只羊却非常健康。巴斯德还不满足：“我们得等到6月5日，等到实验圆满成功，等到获得具有决定意义的证明。”
6月4日，没接种疫苗的25只羊全部死亡，可接种过的一只也突然死亡，但兽医学会当场解剖了死羊，证明其死于妊娠中的意外情况。
兽医毕奥心悦诚服了，他奔向巴斯德：“巴斯德先生，用你的菌苗给我接种吧——就像你对这些你曾如此神妙地救它们性命的羊一样——然后我愿让你注射最毒的毒菌！人人都必须深信这个奇妙的发现呀！”
又一个对手走过来：“我嘲笑过微生物，但我现在是悔改的罪人了。”
巴斯德爽朗地引用了《福音》上的话说：“天上因为有了一个忏悔的罪人而欢乐，比因为有九十九个不需忏悔的正直人而更加欢乐。”
从前认为巴斯德一定会失败的人，满腹狐疑的人，还有冷眼旁观的人一下子都变成了热烈的追随者和崇拜者，普伊福特农场当即决定改名为巴斯德庄园。消息传开，整个法国震惊了，全世界都在瞩目这一伟大的贡献，它为人类战胜传染性疾病开辟了免疫学的新途径。
过去对巴斯德褒贬不一的评价，理应变成了一片颂扬，共和国政府决定授予他荣誉军团大勋章，但巴斯德提出了—个条件：只有为鲁和尚贝朗授予红色绶带，他才接受大勋章。政府同意了巴斯德的请求，消息传来，巴斯德和这两位助手在满是兔子和豚鼠的实验室里互相祝贺开了。
巴斯德和助手们名声大振，每天收到大量来自法国各地和一些其他国家发来的求救信函，他们有求必应，不停地制作菌苗，到了忘我的程度。
1882年，巴斯德顺利地当选为法兰西学院的院士，人们为他欢呼。
农民们在大街上遇见他会挥动草帽高喊：“巴斯德万岁！您拯救了我们的牛羊！”
医生们也向巴斯德表示敬意，他们说：“让我们一起为未来医学的先驱，人类的造福者，杰出的巴斯德的崇高声誉而干杯！”
英国的生物学家赫胥黎赫胥黎说：“单是巴斯德做出的贡献就足以抵偿法国于1870年付给德国的50亿战争赔款。”
法国的内阁提议，把1874年褒奖给巴斯德的12000法郎年金增加到25000法郎。
在伦敦国际医学大会上，巴斯德受到极为热烈的欢迎，暴风雨般的掌声使他误以为威尔士亲王驾到了，大会主席笑着说：“他们是在为你欢呼。”巴斯德以其伟大的发现为祖国争得了荣誉。
巴斯德已誉满法国及整个欧洲，此时他已是60开外的老人了，似乎应该躺在荣誉上休息了，可他不，他说：“我只是把这些看成是激励我继续前进的动力，直到我完全丧失精力为止。”