在成立特委和军委后的第二天，即2月24日，周恩来参加了上海区委各部书记会议和各区军事专员会议，向他们详细了解情况。在晚上的特委会议上，周恩来提出了军事准备工作的五项具体意见，即建立领导机构，加强队伍训练，加强敌军工作，做好武器准备，抓好情报工作。为了落实各项措施，周恩来不仅亲自到重点单位去了解起义准备情况，还亲自作动员工作，并组织了军事训练班，特意从北伐军中调来共产党员、黄埔一期毕业生侯镜如负责工人纠察队的训练工作。
3月初，北伐军分两路进逼上海：一路由西向东，经宜兴取常州，一路从南向北，由嘉兴攻松江。整个局势越来越紧迫，周恩来的军事准备工作也已经做得十分细致。3月20日，北伐军攻克松江，前锋在傍晚推进到上海南郊的龙华，上海工人第三次武装起义的条件成熟了。
3月21日，起义开始，周恩来在总指挥部的西厢房里指挥着各处的行动。同时，他还亲自指挥了火车站、东方图书馆等几处的战斗，并在战斗中身先士卒，冲锋在前。在火车北站的战斗中，因为居民房失火，一部分兵力被调去救火，敌人乘机出击，企图突围，工人纠察队被迫后退。在这关键时刻，周恩来亲自指挥一支突击队冲上去，会合前线的纠察队猛烈回击，把敌人打回北站，夺回了防御工事。在火力掩护下，救火工作也顺利完成。
经过连续30小时的战斗，上海工人第三次武装起义终于取得了胜利。五千多名工人纠察队员，从150杆破旧枪枝和少量手榴弹开始，不断夺取敌人的武装来武装自己，有计划地扩大胜利成果，终于打败五千反动军警，依靠自己的力量解放了上海。这次成功的工人武装起义不仅在中国革命史上抹上了浓重的一笔，同时也是世界工人阶级武装起义史上有数的成功记录之一。作为起义总指挥的周恩来，表现出了其坚决果断、细致周密、从容沉着、指挥若定的军事才能与领导才能。
1927年4月11日深夜到12日凌晨，蒋介石向工人阶级开始下毒手。各处工人纠察队由于缺乏斗争经验，都被国民党给缴了械，造成了难以挽回的损失。13日，上海总工会会所被封闭。14日下午，上海特别市临时市政府被强行解散，中国共产党的组织被迫全部转入地下。这就是四一二反革命政变。
四一二政变后，周恩来坚决主张对蒋介石进行政治上和军事上的讨伐，起草了致中央的电报，与赵世炎、罗亦农、陈延年、李立三、尹宽联名发出，这便是《迅速出师讨伐蒋介石》文。电文强调必须坚决讨伐蒋介石，并且针对陈独秀主张对蒋缓和妥协的右倾主张提出了不同的看法，指出：“再不前进……政权领导尽将归之右派，是不仅使左派灰心，整个革命必根本失败无疑。”这一电文中表现出周恩来的长远战略眼光，不过可惜的是这一意见后来并未付诸实施。
1927年5月下旬，周恩来到达武汉。在十多天前闭幕的中共五大上，周恩来被选为中央委员，在五届一中会全上被选为政治局委员，并任中共中央秘书长。在周恩来到武汉后的第十次中共中央常委会议上，他转任中央军事部长。随后，他又代理张国焘的中央常委职务，参加中共中央的核心领导。
在周恩来负责中央军事工作期间，曾经尝试过进行最后一次的努力来挽救革命——发动湖南农民暴动，当时，湖南农民运动的力量很强，并且拥有不少自己的武装力量。叶挺的部队击败夏斗寅部后正驻军湘鄂边境，而唐生智主力大多还在河南，没有回师两湖。如果抓住这一良机在群众基础良好的湖南发动暴动，是有成功的可能的。
周恩来提出的报告中指出：现在浏阳、平江一带的农军还有八千支枪，军事部已派了军事干部10人去那里进行组织，计划先取湘潭，集中浏阳、平江，全力攻下反动势力薄弱的城池，而在反动势力较强的地方则以打土豪劣绅为主，在可能范围内成立乡村的临时委员会。但是这一计划最后遭到国际代表反对而流产。
1927年7月中旬，中共中央根据共产国际的指示进行改组，陈独秀离开领导岗位，由张国焘、周恩来、李维汉、张太雷、李立三五人组成临时常委会。经过这次改组，主张武装反抗国民党屠杀政策的力量在中央取得了领导地位，也为南昌起义的发动开辟了道路。
7月15日，汪精卫等控制的武汉国民党中央召开“分共”会议，决定同共产党决裂，公开背叛革命。至此，由国共两党合作发动的轰轰烈烈的国民革命宣告失败。正是在这种形势下，中共中央毅然作出由周恩来领导发动南昌起义的决定。
在中国革命生死攸关的关键时刻，力主用武装的革命反对武装的反革命，领导南昌起义，打响了武装反抗国民党反动统治的第一枪，开始了创建人民军队，进行武装斗争的新时期。
1927年7月间，受中国共产党掌握或影响的部队主要集中于张发奎的国民革命军第二方面军中。即叶挺的第十一军第二十四师，第四军二十五师则是以原叶挺独立团为骨干扩编的，深受共产党影响，还有接近共产党的贺龙的第二十军。七一五反革命政变之后，汪精卫、张发奎正准备在第二方面军中“清党”，叶挺、贺龙得知这一阴谋后，拒不执行将部队集中到德安的命令，而把部队开到南昌及其附近地区。在革命形势千钧一发的关头，为了保留这仅有的革命力量，中央决定在南昌发动暴动。
7月24日，罗米那兹·加伦、张国焘、周恩来在武汉举行会议，决定在南昌举行起义。并根据加伦的提议，规定起义后部队的行动方向：立即南下，占领广东，取得海口，以取得国际援助，再举行第二次北伐。这样，南昌起义的部署正式确定。
7月27日，周恩来从九江赶到南昌。同一天，前敌委员会成立，由周恩来、李立三、恽代英、彭湃组成，周恩来任书记，并决定在30日晚间举行起义。
领导南昌起义时的周恩来。第二天，周恩来到二十军指挥部去看贺龙，告诉他行动计划。贺龙毫不犹豫地回答：“我完完全全听共产党的话，要我怎样干就怎样干。”
7月30日早晨，以中共中央代表身份赶到南昌的张国焘主张一定要得到张发奎同意才能举行起义，这一意见遭到前委的一致反对，周恩来更是气得生平难得拍了桌子，当天的会议没有达成最后的意见。第二天的会议上，张国焘终于放弃了自己的错误主张，表示服从多数。于是，决定在当晚行动。
在起义准备进入最后阶段的时候发生了一件意外情况：第二十军第一团一个副营长跑到敌人指挥部告密，这个军的一个士兵发现后立即向贺龙报告，前敌委员会当机立断，决定提前两个小时发动起义。
8月1日凌晨两点，随着南昌城头三响清脆的枪声，三颗红色信号弹腾空而起，起义开始了。周恩来在起义总指挥部亲自指挥战斗，他指挥沉着、果敢，考虑问题周密、详致。到清晨6时，城内的敌军被全部肃清，共歼敌3000多人，缴枪5000多支，子弹70多万发，还有大炮数门，起义成功了。起义胜利后，选举产生了25人组成的国民党革命委员会，周恩来是其中一员。
8月2日，聂荣臻、周士第率领在马回岭起义的第四军二十五师两个团3000余人赶到南昌。周恩来见到他们后十分高兴，说：“行动很成功!我原来没想到这样顺利，把二十五师大部分都拉出来了。”再加上临时参加的蔡廷锴部第十一军第十师，起义军的兵力达到两万余人。
8月3日开始，起义军按照原定计划，分批撤离南昌，南下广东。起义军的南下路线走的是周恩来所主张的由赣东经寻乌直取东江的路线，因为赣东敌人力量较弱，东江又是广东农民运动发达的地区，在这一地区能较快地取得当地群众的支持，起义军沿着这条路线踏上了南征的道路。
8月4日，蔡廷锴部第十师突然脱离起义部队，一下子拉走将近四分之一的兵力。并且由于反动派的造谣，沿途的居民大多逃散，部队连食物和茶水都难以买到，结果造成大量的非战斗减员。
7日起，起义军陆续到达临川(抚州)，这时部队的军饷日益困难。在周恩来等的坚持下，改变了原来派款、提款、借款的办法，实行征发(如征发地主的粮食)、没收(没收豪绅反动派的财产)和对土豪劣绅罚款的新政策，部队的筹饷情况有所好转。
起义军接下来在瑞金和会昌同敌人钱大钧部进行了两场战斗，在付出了巨大的代价后取得了胜利，周恩来在战斗中都是在前沿阵地亲自指挥。
8月31日，前委决定改变原来取道寻乌入东江的计划，改由长汀、上杭入东江。之后，起义军攻下长汀，占领三河坝，到了9月24日，占领汕头。起义军进驻汕头后，成立市政府，恢复社会秩序，但此时敌人的重兵已经开始集结到潮汕周围了。由于对敌情的了解有误，在经过几次战斗后，起义军伤亡很大，不得不先后撤离潮州和汕头。
周恩来此时染上了重病，但在10月3日的流沙会议上，他还是作了报告，检讨了失败的原因，并对剩余人员的去向作了安排，准备去海陆丰坚持长期斗争。在离开流沙后，部队在一个三面环山的小盆地里受到陈济棠部的伏击，起义军很快就被冲散。周恩来此时已病得更严重了，常常处于昏迷状态，他在叶挺、聂荣臻和地方党的负责人杨石魂的护送下乘坐小船去了香港，震惊中外的南昌起义就这样结束了。
南昌起义，揭开了我党独立组织军队和领导武装斗争的序幕，打响了反对国民党反动派的第一枪，开辟了一个新的时期，揭开了历史上新的一页。
南昌起义的枪声让革命群众在黑暗中看到了新的希望，让他们看到了新的道路。从此以后，无数的革命志士在中国共产党的领导下，前赴后继，沿着南昌起义的革命道路，历尽艰辛，终于打开了中国革命的新局面。中国共产党领导下的人民军队就是在这次起义中诞生的，作为南昌起义前敌委员会书记的周恩来，他创建人民军队的丰功伟绩，载入了中国人民革命斗争的光辉史册。