在中共六大上，周恩来认识到中国革命有割据的可能，指导红军和农村革命根据地的工作。主持起草中央“九月来信”，统一红四军党内思想。
1927年11月，周恩来从九龙回到上海，参加11月召开的中共中央临时政治局扩大会议。会后任中央组织局主任，仍主管军事工作。从1928年1月起，周恩来担负起处理中共中央日常工作的责任。当时的中央“左”倾盲动主义占据着统治地位，周恩来感觉到军事冒险行动在当时是危险的，也做了努力去纠正，但仍不能从根本上纠正“左”倾盲动主义的错误。
在这一期间，周恩来主张让贺龙回到湘西去，建立工农革命军，开展武装斗争。到3月又前往香港纠正李立三在处理广州起义善后中的“左”的错误。在收到共产国际2月作出的《关于中国问题的决议》后，周恩来对国民党统治区秘密工作和红军工作作了新的指导。周恩来的这些工作，为国民革命后在各地重新恢复遭受严重破坏的党组织，建立并发展中国工农红军作出了重要贡献。
1928年6月，中央六大在莫斯科召开。会议主题是总结大革命失败的经验教训，特别是八七会议以来的党的工作，制订党在新时期的路线、方针、政策。
在讨论政治报告时，周恩来作了长篇发言。在这次发言中他特别强调：由于中国革命的不平衡性等原因，证明中国革命有割据的可能。当全党还把城市工作放在中心地位的时候，他的这种认识虽还不够明确和系统，但仍是十分可贵的。
在会上周恩来还代表党中央在会上作了关于组织问题和军事问题的报告。在军事报告中他肯定了国民革命时期党在军队政治工作中所取得的成绩，但也指出党的军事工作一直存在一个根本性的错误观念，即不明确军事工作的根本任务是在与资产阶级争夺领导权的原则下发展我们的军事力量和政治影响。
同时周恩来专门谈了建立红军的问题。他说：建立红军的原则，一是要把旧军队的雇佣性质加以改变，可先采取志愿兵制；二是军官不一定非工农分子不可，但一定要无产阶级化；三是红军一定要有政治工作。他还指出：红军一定要与工农群众打成一片，否则就“失了红军的阶级基础”。红军要帮助苏维埃政权的发展，要有移动的条件，红军的组织以适合当地需要为原则，红军的军事指挥要有集中原则。周恩来的这些建军思想是有着重要意义的。
在六届一中全会上，周恩来当选为中央政治局常委，后兼任中央组织部部长、中央军事部部长、中央军委书记，分管党的组织工作和军事工作。此后，周恩来较长时间在上海中央机关参加秘密领导全国革命工作。在这段时间他联系和指导各地区的武装斗争和国党统治区的秘密革命工作，并负责中央机关的安全保卫工作。
六大前后，中国农村的革命游击战争处在一个特别艰难的时期。那时国民党的统治暂时稳定，可以集中兵力对红军进行“清剿”。1928年5月，广东海陆丰苏维埃政权和工农红军遭到失败。6月，陕西渭华起义中组成的西北工农革命军在优势敌人的进攻下也以失败告终。8月，工农红军第四军在湘南遭受八月兵败。这时的红军处在了一个异常艰难的时刻。
在这种情况下，六大强调了建立工农红军的重要性，肯定了中国农村革命根据地和工农红军能够存在和发展。但是它总的观念仍是强调要以城市为中心，对农村斗争和武装割据的作用估计不足，对农村游击战的指导也有失误。共产国际当时认为中国红军只能分散存在，如果集中，容易被敌人消灭，并且会妨害老百姓利益，并要求高级干部离开红军，提出调朱德、毛泽东去学习。
按照共产国际的指示，中共中央让周恩来在1929年2月7日起草了给红四军的指示信，这封信通称为“中央二月来信”。信中要求红四军实行分散，并要求朱德、毛泽东离开红军，到中共中央工作。这一指示从整体上说是错误的，但随着客观形势的发展，到了5月，中央的认识也已改变，调朱毛出来的事，也就作罢。
红军这种困难的局面并没有持续太久，客观局势就发生了重大变化。以1929年3月蒋桂战争爆发为起点，国民党各派军阀之间又开始了无休止的混战。许多原来“会剿”工农红军的部队纷纷调往军阀混战的战场，工农红军的压力顿然减少，这也就给了红军以较大的发展机会。
此时的周恩来作为党中央工作的主要主持者和军事工作的负责人，为联系和指导各地的武装斗争作了巨大努力。周恩来领导的中央军事部委派徐向前，邓小平、张云逸分别到鄂东北和广西工作。1929年3月19日，周恩来为中央起草了给贺龙和湘鄂西前委的指示信。信中强调在农村中发动群众，开展游击战争，深入土地革命，建立农村苏维埃政权的重要性。“目前所应注意者，还不是什么占领大的城市，而是在乡村中发动群众，深入土地革命。故你们此时主要的任务，还在游击区域之扩大，群众发动之广大，决不应超越了主观的力量，而立刻企图占领中心工商业的城市。”他指出发动游击战争应该是在农村阶级矛盾与斗争更激烈的地方，党与群众的组织有相当基础的地方，以及给养丰富、地势险峻的地方为宜。
1929年9月，周恩来在上海听取了陈毅关于红四军情况的汇报。在与陈毅多次谈话的基础上，他宣布了中央关于朱德、毛泽东仍留前委工作，毛泽东仍任前委书记的决定。陈毅按照周恩来谈话的精神，代中央起草了一封指示信，经周恩来审定后，带回红四军。周恩来又嘱托：回去后，要请毛泽东复职，并召开一次党的会议，统一思想，分清是非，作出决议，维护毛泽东和朱德的领导，这封信便是9月28日的《中共中央给红军第四军前委的指示信》。
这封信分析了当时的政治形势，指出“先有农村红军，后有城市政权，这是中国革命的特征，这是中国经济基础的产物。如有人怀疑红军的存在，他就不懂得中国革命的实际，就是一种取消观念”。信中还谈到了红军的任务与前途、红军的发展方向和战略、红军与群众、红军的组织和训练、红军的给养和经济问题、红军的当前行动等问题，并强调了加强党对红军领导的问题。
这封指示信在10月20日由陈毅送达红四军前委。12月底，中共红四军第九次代表大会(古田会议)召开。根据中央9月来信的精神，红四军不仅胜利地渡过了危机，并且进一步解决了以农民为主要成分的军队如何建成无产阶级的新型人民军队这一至关重要的问题。在这一过程中，周恩来主持起草的中央九月来信对统一红四军党内的思想、开好古田会议是起到了巨大作用的。
在周恩来主持中央军事工作的这一年多时间里，即六大后到立三路线前，他筹划和主持建立了红军、苏区与中央的联系交通网；开办了军事训练班，训练和派遣一批批骨干支援各个苏区和红军或从事兵运工作；总结和交流各革命根据地武装斗争的经验，指导红军的斗争和建设。红军和根据地有了很大发展，并在周恩来主持下建立了统一的红军战斗序列。到1930年3日，红军已有第一军到第十三军共13个军，62730人，28982支枪，建立了湘赣、赣南、左右江等15块农村革命根据地。
1930年9月30日，在六届三中全会结束后，周恩来主持召开中央军委扩大会议。他在会上作了《目前红军的中心任务及其几个根本问题》的报告和结论。提出“今天来讨论红军，根本任务就是要解决如何使红军成为工农民主专政的主要力量的问题”。要求密切红军中上下级之间的同志关系，废除“官”与“兵”的称呼，“一律用‘红色指挥员’、‘红色战斗员’来代替”。游击队和游击战术绝对不能取消，但要有现代化战术的充分准备，并建立集中指挥，建立总司令部。
1931年1月，六届四中全会召开，周恩来当选政治局委员，并在随后举行的政治局会议上当选为中央常委。30日，中央又决定周恩来兼任中央军委书记，负责红军和苏区的指导工作。
1931年3月2日，也就是蒋介石发动第二次“围剿”前将近一个月，周恩来主持起草了中央给一、三集团军总前委等的信。信中根据中央掌握的谍报材料，通报了第二次“围剿”的几个特点。周恩来在发信前，又添写了重要的一段：“在战略上，当着敌人力量尚未集中的时候，我们必须利用优势击溃敌人的主力。当着敌人大举包围，我们必须利用敌人的弱点，击溃敌人的一方。如能诱敌深入，聚而歼灭他，这也是可采用的战略。”这些战略上的重要思想对根据地的反“围剿”是有着一定的指导作用的。对于赣东北、湘鄂西、鄂豫皖等根据地红军的军事行动，周恩来也给予了许多具体指示。
赣东北根据地在方志敏等领导下蓬勃发展，打破了敌人的第一次“围剿”，正准备对付第二次“围剿”。周恩来在2月19日起草的《给赣东北特委的指示信》中，要求面对着优势敌人的红军，在农民游击战争的配合下，用各种方法“来疲敝与涣散敌人的战斗力，在适当的力量对比上，击破敌人的一方，给敌人以各个击破，这样来冲破敌人的‘围剿’”。
贺龙领导下的湘鄂西根据地，在敌人的“围剿”下，丧失了大片土地，形势严峻。周恩来在3月10日起草的《给湘鄂西特委信》中，批评了那种“只凭脱离群众的单纯的军事行动企图取得大城市及至最大城市”的错误观念，要求他们树立“巩固苏区、建立根据地与改造红军的根本认识”。“在湘鄂西要特别注意的是发动群众的游击战争”。“要能在配合群众的斗争、利用敌人的弱点的条件下，击破这一线敌人的一方”，“各个击破敌人”。“只有使红军真正成为接近群众、发动群众的阶级军队，使红军真正成为实现土地政纲、保卫苏维埃政权的军队，则红军才能得到广大群众坚固的拥护。”
关于鄂豫皖根据地的斗争，周恩来强调鄂豫皖特区必须在巩固的基础之上再向外发展，扩大苏区，并用“可以与次要的敌人结暂时军事联盟，打击主要的敌人”。
从1930年冬至1932年春，各革命根据地军民不畏强敌，团结奋斗，在大约一年半的战斗中，不仅重创了敌人，更发展了自己，农村根据地得到巩固和扩大，这一切都与周恩来的工作是分不开的。
1931年周恩来到达瑞金，就任中共苏区中央局书记。同毛泽东、朱德等对红军进行了改编和训练，在第四次反“围剿”中灵活机动，沉着冷静，同朱德一起领导红军取得了反“围剿”的胜利。
1931年12月底，周恩来抵达了中央革命根据地的中心——瑞金，就任中共苏区中央局书记，此时的中央革命根据地已取得了巨大的发展。不仅粉碎了敌人的第三次“围剿”，还争取了1.7万名敌人在宁都起义，这两个胜利使得中央苏区迅速扩大，赣南和闽西这两个革命根据地已连成一片，土地革命进行得红红火火，红军也得到发展壮大。不过，当时中央苏区形势尽管较好，但问题仍然很多，最重要的仍是军事问题。
当时，由博古负总责的临时中央推行的是一条比李立三更“左”的错误路线，一味要求红军攻打中心城市。1932年1月9日，临时中央就要求工农红军将“各苏区联系成整个一片的苏区，并以占取南昌、抚州、吉安等中心城市，来结合目前分散的苏维埃根据地，开始湘鄂赣各省的首先胜利”。
周恩来在同毛泽东交换意见后，根据对实际情况的估计，致电临时中央，表示攻打中心城市有困难，临时中央复电表示至少要在抚州、吉安、赣州中选择一个城市攻打，毛泽东对此仍不同意。周恩来和苏区中央局多数领导人则认为赣州是可以打下来的，2月3日，围攻赣州的战役打响。由于对敌情判断有误，守敌有1.8万余人，是原来估计的一倍，而攻城的红军才红军时期的周恩来。1.4万余人。加上赣州又易守难攻，在战斗了33天后，红军撤出战斗，战役失败。
在随后的漳州战役中，周恩来坐镇长汀，组织兵力，筹集给养，保障了前线需要，为攻克漳州作出了重要贡献。
8月初，红一方面军和苏区中央局在兴国附近的竹坝分别召开会议。这两个会议决定：一、红军主力北上消灭乐安、宜黄、永丰之敌；二、对红军进行整编。同时也决定在前方组织军事最高会议，由周恩来、毛泽东、朱德、王稼祥组成，以周恩来为主席，负责处理前方的行动方针和作战计划。
在取得乐安、宜黄战役的胜利后，红军本想乘胜攻取南城。8月24日，周恩来随军抵达南城近郊。发现敌军已准备充分，加之工事坚固，红军主动撤至东韶、洛口一带休整，寻找战机。
但临时中央和苏区中央局在“左”倾思想的指导下顽固地要求红一方面军继续北上，威胁南昌。于是，以临时中央和苏区中央局为一方，以前线的周恩来、毛泽东、朱德、王稼祥为另一方，双方在作战方针上形成了尖锐的对立。
在随后的几个月中，双方以电报的方式对作战方针继续进行争论。周、毛、朱、王继续坚持应机动灵活，抓住敌人弱点，以求各个击破。临时中央、苏区中央局仍坚持要一方面军与鄂豫皖、湘鄂西红军相呼应，与正面敌人作战。矛盾在这样的争论中没有调和反而更加尖锐，直接的后果就是苏区中央局全体会议在1932年10月上旬召开，史称宁都会议。
在这次会议上，与会的大多数人批评前方军事领导人“有以准备为中心的观念，泽东表现最多”。他们要求把毛泽东召回后方负责政府工作，前方由周恩来负总责。周恩来在口头上承认了前方军事领导人的错误，但并不同意把毛泽东召回后方，他说：“泽东积年的经验多偏于作战，他的兴趣亦在主持战争”，“如在前方则可吸引他贡献不少意见，对战争有帮助。”但由于中央局对毛泽东的不信任，毛泽东还是回到了后方。10月26日，临时中央宣布周恩来兼任红一方面军总政委。
宁都会议后，朱德、周恩来随军从广昌出发，赴前线指挥作战。在短时期内，他们连克7城，扩大苏区地域数百里，建立了闽赣省，并使闽北和闽西革命根据地连成一片。