然而，正是由于她与载淳的关系和对他的照顾远远超过载淳的生母慈禧太后，才引起慈禧太后的猜忌。而且慈安太后为人宽厚仁爱，在宫中、在同治帝心中具有崇高地位和影响力，这更是意欲专权的慈禧太后所不能容忍的。
穆宗死后，载湉被立为帝，即德宗，亦称光绪皇帝。由于德宗皇帝即位时年纪尚幼，两宫皇太后二次垂帘听政。这时虽然是二人同时训政，但慈安太后已无一分权力。实权都掌握在慈禧太后手中。在光绪年间，她诚心信奉佛教，在宫中天天以吃斋念佛为主要功课。这样，慈禧太后更觉无所约束，益加肆意弄权，胆大妄为了。
光绪一朝，慈安太后日益倦怠不闻外事，而慈禧太后则日益振奋统摄全局大权独揽。从生活上说，慈安太后崇尚节俭，不事铺张，而慈禧太后却肆无忌惮地挥霍。慈禧太后经常单独召见大臣，决定大事要事逐渐地也不再告知慈安太后。过去她哪敢这样做，像同治年间补瑞麟为文华殿大学士，这样的大事，她都要找慈安太后商量，取得慈安太后的同意后才可以实施。后来慈安太后竟成了可有可无之人，这使慈安太后心内愤愤不平，两人之间的矛盾也逐渐突出起来。
没过多久，慈安太后突然暴薨了。
光绪七年（1881年）三月初十日戌时，慈安逝于钟粹宫，终年45岁。慈安之死，事先并没有什么明显的征兆。三月初九日，慈安身体稍感不适，第二天晚上就死了。光绪帝对慈安的猝然而逝，深为不解：“初九日，慈躬偶尔违和，当进汤药调治，以为即可就安。不意初十日病情陡重，痰涌气塞，遂至大渐，遽于戌时仙驭升遐。”
事出太过突然，令朝野皆惊。
慈安太后为人慈祥和蔼，以仁厚著称于大内，平日很少责罚太监、宫女。有时小太监的衣服挂破了，她还亲自给缝上。她的猝然薨逝，使钟粹宫的太监、宫女们如丧考妣，一时间哭声恸天。那班大臣们听了，个个面面相觑，目瞪口呆。内中恭亲王最是关心，听后便禁不住号啕大哭起来。诸大臣劝住了恭亲王的哭，赶进东太后寝宫去，见慈禧太后坐在矮椅上，宫女们正在替东太后入殓。大臣们看了这个情形，忍不住个个掉下眼泪来。只听得西太后自言自语地说道：“东太后一向是一个好身体，近来也不见害病，怎么忽然丢下我去了呢？”慈禧太后一边数说着，一边伏在尸身旁呜呜咽咽地痛哭起来。诸位大臣见西太后哭得伤心，便一齐跪下来劝解着，说皇太后请勉抑悲怀，料理后事要紧。照宫廷的旧例，凡是帝后上宾，所有药方医案都要交军机大臣验看；如今东太后死得这样快，所以也不及延医服药，也不曾留得方子。后妃死后，照例又须召椒房戚族进宫去看着入殓。如今西太后的主意，不叫去通报东太后的母家钮钴禄氏的族人，大臣们也没有人敢反对，一任那班宫女在那里替东太后草草成殓。慈禧太后同时把一班军机大臣召唤到自己书房里去，商量拟遗诏的事体。
那遗诏上说道：
予以薄德，只承文宗显帝册命，备位宫阃；迨穆宗毅皇帝寅绍丕基，孝思纯笃，承欢奉养，必敬必诚。今皇帝入缵大统，视膳问安，秉性诚孝。且自御极以来，典学维勤，克懋敬德，予心弥深欣慰！虽当时事多艰，宵旰勤政，然幸体气素称强健，或冀克享遐龄，得资颐养。本月初九日，偶染微病，皇帝侍药问安，祈予速痊；不意初十日病势陡重，延至戌时，神思渐散，遂至弥留。年四十有五，母仪尊养，垂二十年；屡逢庆典，迭晋徽称，夫复何憾！第念皇帝遭兹大故，自极哀伤；惟人主一身关系天下，务当勉节哀思，一以国事为重，以仰慰慈禧端佑康颐昭豫庄诚皇太后教育之心。中外文武，恪供厥职，共襄郅治；予灵爽实共与嘉之。其丧服酌遵旧典，皇帝持服二十七日而除；大祀固不可疏，群祀亦不可辍。再予向以俭约朴素，为宫闱先，一切事关典礼，固不容骄纵抑损；至于饰终遗物，有可稍从俭约者，务惜物力，即所以副予之素愿也。故兹昭谕，其名遗行。
一道遗诏，便轻轻把一桩绝大的疑案掩饰过去了。那孝贞皇太后的家族也不敢问信。光绪七年（1881年）九月二十七日，慈安被安葬在普祥峪定东陵，谥号“孝贞慈安裕庆和敬诚靖仪天祚圣显皇后”。