生物制氢是世界各国氢能发展计划中的一个重要组成部分。尽管生物制氢离实际应用还有很大的距离，然而生物制氢具有常温常压操作、低能耗以及环境友好等特点，是符合“氢能经济”战略目标的理想的制氢技术，因此世界各国均将生物制氢视为氢能制备的关键课题。美国能源局(DOE)根据氢能计划所组织的与制氢技术相关的课题中，涉及生物技术制氢的课题约占1／3。
2.生物制氢体系
氢是组成水和生物有机物质的基本元素。在有机质发酵降解过程中，在微生物利用太阳能光解水的过程中，氢是重要的中间产物及主产物，因此微生物具有产氢功能是自然界中较为常见的现象。曾有人对地球上微生物生命活动中的年产氢量作过估算，他们认为在缺氧环境下，厌氧微生物和兼性耗氧、厌氧微生物年产氢总量约2×108t；在有氧环境下，好氧微生物和喜微氧微生物在固定N2的过程中同时产氢，其年产氢总量约lO7t。这些氢将由其他非产氢微生物或产氢微生物自身通过吸氢酶系统消耗，因此这些微生物所处环境的实际氢浓度极低。
从能源制氢出发，自然界中可利用的产氢微生物主要有绿藻、蓝藻、光合成细菌和暗发酵细菌四大类。
绿藻和蓝藻(常称为蓝细菌)依靠体内的光合作用系统吸收太阳能光解水产氢，同时放出氧气。光合成细菌和发酵细菌则通过厌氧光发酵或暗发酵分解还原性有机物产氢，同时生成CO2。一种无硫紫色光合细菌能够利用CO还原水产氢(即催化水气变换反应)，形成了又一种产氢模式。以乳酸作为还原性有机物的代表，可将三种模式的化学反应方程比较如下：
H2OH2+12O2(4-21)
C3H6O3+3H2O6H2+3CO2(4-22)
CO+H2OH2+CO2(4—23)
方程表示了三种产氢模式的总包反应，在微生物体内的实际过程则由含氢化合物的分解及质子还原两个主要步骤构成，三种模式的区别在于质子还原步骤所需电子的原始供体分别为H2O、还原性有机物和CO。
质子还原产氢的反应将依靠微生物体内的产氢酶催化完成。不同类型的微生物，催化产氢的酶不全相同。绿藻和暗发酵细菌的产氢酶为可逆性氢酶；蓝藻和光合细菌则依靠固氮酶催化产氢。微生物产氢过程还存在各种抑制，O2、CO、N2、NH+4均是抑制物，不同的微生物抑制物不尽相同。
3.产氢酶
产氢过程中直接还原质子为氢气的酶有固氮酶和氢酶两种。
(1)固氮酶(nitrogenase)。固氮酶是由两个蛋白分子构成的金属复合蛋白酶，具有在常温、常压下将N2还原为NH3的功能。其中含有固氮活性中心的蛋白称为钼铁蛋白，又称为二氮酶(dinitrogenase)或蛋白Ⅰ(proteinⅠ)，目前已在蓝藻中发现两种由钒和铁代替钼的二氮酶，但绝大多数二氮酶为钼铁蛋白。已确定钼铁蛋白是由两种亚基构成的α2β2型四聚体，相对分子质量为220000～240000。α亚基的相对分子质量约55000，由nifD基因编码；β亚基的相对分子质量约60000，由nifK基因编码。钼铁蛋白中存在两种金属原子簇——M簇和P簇，前者称铁钼辅因子(FeMoCO)，后者由8个铁硫中心构成。
组成固氮酶的另一种蛋白为铁蛋白，又称为二氮还原酶和蛋白Ⅱ。
二氮还原酶是由一种亚基组成的y2型二聚体，相对分子质量约为60000～70000，由nifH基因编码。二氮还原酶在Mg—ATP存在条件下，具有将外供体的电子转移给二氮酶的功能。
固氮酶催化反应存在着O2抑制现象，同时N2和NH+4因抑制微生物体内固氮酶的表达而抑制含酶微生物的固氮效应。
(2)氢酶。氢酶是微生物体内调节氢代谢的活性蛋白。从其催化功能出发，氢酶可分为吸氢酶和可逆性氢酶；从酶蛋白的活性中心金属出发，氢酶有铁氢酶、镍铁氢酶和无金属氢酶三种。
氢酶被认为是一种铁硫蛋白，且绝大多数氢酶都带有镍。不同的微生物其所含氢酶的酶学特征和遗传特征均有一定的差异，其中蓝藻氢酶的研究相对较为清晰。
4.生物产氢过程
以能源制氢为目标的生物制氢过程，主要有如下四类：
①微藻光生物水解制氢；
②光合细菌光分解有机质制氢；
③有机物暗发酵制氢；
④光合细菌与发酵细菌混合制氢。
微藻制氢涉及到绿藻和蓝藻两类光自养型微生物。两种藻类均具有与植物类同的两个光合作用系统PSⅠ和PSⅡ(photosystem“Ⅰ”and“Ⅱ”)。PSⅡ吸收光能，光解水产生O2和质子、电子；PSⅠ则可提高经电子传递链到达电子的电位并产生还原剂用于CO2的固定或H2的形成。植物中不存在产氢酶，因此植物光合作用只产生碳水化合物不产生H2。尽管微藻产氢现象的发现源于绿藻产氢，但蓝藻产氢的研究远比绿藻产氢更为系统和深入。鉴于两种藻类产氢的工艺过程基本类同，因此蓝藻产氢研究的进展特别是相关工程、工艺的研究对绿藻制氢研究的实用化均有帮助。
微藻产氢的基本优点是能够利用太阳能直接以水为原料制氢。其中绿藻制氢的太阳能转化效率是某些植物光合作用效率的10倍，有可能达到10％(太阳能光解水制氢的可实用化的转化效率下限)。绿藻制氢的缺点在于产氢酶的氧抑制现象严重，产氢持续时间过短，此外，对光生物反应器要求苛刻，成本较高。
光合细菌只具有光合系统Ⅰ即PSⅠ，依靠PSⅠ在限氮等产氢条件下，有机质被光氧化产生电子，并依靠固氮酶将H+还原为H2。光合细菌产氢具有较高的理论产氢效率，并能利用较宽的光波带，且不存在释氧过程，可与废水处理相结合。其缺点在于光反应器要求较高，产生的气体中有较多的CO2，同时发酵废液的处理将增加成本。总体看光合细菌被认为是富有潜力的产氢系统，并已有较深入的研究。
在异养厌氧微生物发酵过程中，有机物的降解提供了生物合成所需的能量，同时产生过剩的电子流。这些电子流的处理成为该类微生物维持正常生长代谢的重要环节。许多微生物中存在有较高活性的氢酶，氢酶利用过剩电子产生氢气成为微生物调控电子流的有效方法。
有机物暗发酵制氢具有非常高的产氢速率，由于无需光，可以日夜持续产氢，同时微生物的生长速率较快，使产氢的生物量极易得到保证。暗发酵制氢也存在气体中含CO2及发酵液排放前必须处理等问题。
有机物暗发酵制氢比光合细菌有更多的优点，但有机质发酵过程产生的有机酸不能进一步利用，采用光合细菌与发酵细菌的混合放氢能克服这一缺陷。混合放氢系统中，厌氧暗发酵细菌的碳水化合物酶降解有机质为有机酸，同时氢酶消耗电子，还原质子为氢气；所产生的有机酸进一步由光合细菌的固氮酶用于光照条件下产氢。
葡萄糖依靠厌氧暗发酵分解提供了负自由能，从而使所形成的有机酸无法再分解为H2，而光合成细菌利用光能克服这一能垒，实现了葡萄糖完全分解为CO2和H2。
5.生物制氢评价、展望
从新能源的研发与环境需求考虑，生物制氢无疑是最为理想的制氢技术。然而生物制氢的成本及价格目前还难以达到能源氢的需求，D．Das曾以生物制氢能量转化效率10％为前提，估算了各种制氢技术的成本。
两步法绿藻光生物水解制氢有发展价值，然而上述成本是在10％光能利用效率前提下作出的估算，而要达到这一效率还需要较为漫长路程。
总体看，各类生物制氢过程都有待发展。从科学发展的需要，各种制氢模式的机理还需要进一步研究，包括其遗传机制、能量代谢与物质代谢过程的清晰描述。从实用化的目标出发，产氢微生物以及产氢酶的改造是研发的重点，具有优良产氢微生物的发现，抗抑制的产氢酶蛋白质工程的研究，能量转化效率的提高均是产氢体系改造的重点内容；低成本、高效率生物反应器的研制，产氢混合气的分离、纯化及相关的安全生产工艺都是生物制氢实用化的工程基础。
目前在各类生物制氢体系中，较为看好的体系为绿藻光解水制氢和光合细菌与发酵细菌混合制氢。然而，各种生物制氢技术均各有其优缺点，为克服其缺点的各类研究也正在发展。美国能源局所组织的生物制氢课题除蓝藻产氢已不再列项外，其余各类生物制氢均有相应的课题，并提供了高强度的研究费用。此外，结合各类微生物的产氢特征，实现共培养产氢的研究也引起了人们的兴趣。
二、微藻光生物水解制氢
微藻在厌氧条件下产生氢气的现象发现于1942年，但微藻制氢的研究却起步于1974年，从此开始，微藻制氢一直是生物制氢研究的一个重点。前二十多年，微藻制氢的研究主要集中于蓝藻即蓝细菌制氢，近十多年来，微藻制氢研究的重点才逐渐转向绿藻制氢。虽然国际能源局氢能和约1998年的年度报告中认为蓝细菌制氢能量的理论转化效率低，无开发前景，但蓝藻制氢的研究也还在继续发展。
1.微藻光解水产氢机制
微藻光解水制氢可分为两个步骤。
第一步，微藻通过PSⅡ吸收光能分解水，产生质子、电子，并释放氧气，其反应式为：
2H2O+hv4H++4e-+O2(4—24)
第二步，绿藻依靠可逆性氢酶，蓝藻依靠固氮酶，还原质子为氢气，其反应式如下：
2H++2eH2(4-25)
N2+8H++8e-+16ATP2NH3+H2+16ADP+16Pi(4-26)
方程(4—25)虽似简单，但绿藻产氢的实际过程却颇为复杂。在正常的光合作用下，处于绿藻叶绿体内的PSⅡ光解水为氧气、电子和质子。氧气透过叶绿体膜，进入线粒体，被线粒体的呼吸作用消耗，并固定CO2。PSⅡ产生的高能电子进入质体醌(PQ)，通过位于类囊体膜上的电子传递链进入光系统PSⅠ。电子传递链由质体醌(PQ)、细胞色素和质体青(PC)组成。PSⅠ上的吸光色素吸收光能，再次激发电子定向传递到类囊体膜外表面的铁氧化还原蛋白与还原型辅酶结合为化学能较高的NADPH，参与固定CO2，剩余的电子将由Fd传递至基质中的氢酶。
PSⅡ光解水产生的质子进入类囊体内腔，使类囊体内腔体液的pH值维持在5左右。腔内的质子主要用于能量物质ATP的合成，质子通过膜上的脂蛋白进入类囊体膜上的偶联因子CF0和CF1，在CF1内由ATP酶转化ADPT为ATP。起质子通道作用，质子在通过CF0和CF1后降低了质子动力势，进人类囊体外的基质。
类囊体膜外为叶绿体的基质，基质中的水电离为氢氧根离子和质子，基质中氢酶利用基质中质子和由Fd传递的电子合成氢气，同时，类囊体内的质子经过质子通道进入基质，使基质体液pH值维持在8左右。氢气生成的速率除与氢酶活性相关外，也与从类囊体内输出质子以及与Fd至氢酶的电子传递速率相关。类囊体质子浓度虽然为基质中的1000倍，但质子通过CF0和CF1的速度却很慢，以维持膜内外质子的浓度梯度。
氢酶位于类囊体膜基质中，基质的氧化还原状态对绿藻产氢有较大影响。还原态的基质有利于氢酶的催化作用；氧化态的基质使电子在基质中快速消耗，无法传递至氢酶，从而降低了绿藻放氢的能力。
鉴于蓝藻产氢是固氮酶过程的副产物，蓝藻产氢机制与绿藻有所不同。许多蓝藻在缺乏氮气、氨和硝酸盐的环境下，能形成具有特殊胞壁结构的异形细胞。固氮酶存在于异形细胞之内，固氮与产氢反应也在异形细胞内发生。但异形细胞内只有PSⅠ而无PSⅡ系统。因此蓝藻光解水产氢涉及到正常细胞和异形细胞两类细胞。正常细胞常称为营养细胞，具有PSⅠ和PSⅡ系统，但不含固氮酶。营养细胞中PSⅡ利用太阳能光解水，所产生的氧气、电子用于固定CO2，合成碳水化合物，并转移至异形细胞。异形细胞通过光合磷酸化和有氧呼吸分解碳水化合物，为固氮酶提供质子、电子和ATP，异形细胞中的铁氧化还原蛋白Fd则为固氮酶的电子供给中间体。异形胞内氢酶主要作用为消耗产生的氢气，调控氢的代谢。营养细胞的氢酶与绿藻中氢酶作用类同，但产氢酶活性很低，产氢效率无法与固氮酶产氢相比拟。
比较两种微藻产氢机制可以看到，蓝藻固氮酶产氢过程，光解水产生的电子仅有1／4用于质子还原，同时还要消耗能量物质ATP，因此蓝藻产氢能量利用效率从理论上远低于绿藻。然而在蓝藻体内，光解水放O2、CO2固定与质子还原产氢发生在两个细胞之内，从而实现了产氧、产氢在时空上的分离；同时异形细胞的特殊腔壁结构具有限制氧气渗入功能，可保护固氮酶免受氧的抑制，维持较长时间地产氢。而绿藻氢酶则因氧的抑制，自然产氢现象只能维持几分钟。
以酶活性相比较，绿藻中氢酶活性远高于蓝藻中的固氮酶。然而，有些绿藻氢酶的体外活性虽然很高，但相应藻体的光合放氢能力并不高。这种现象可能与绿藻产氢时，氢酶的氧抑制，电子、质子传递限制以及物质能量代谢过程的其他限制有关。
产氢酶的遗传和酶学特征是微藻产氢机制研究的重要内容，其主要的结果在上一节中已有简要的阐述。总体看微藻产氢机制及其分子生物学的研究还有待于发展。
2.微藻产氢过程的调控
藻株的筛选和改造是微藻产氢调控的基础。目前已筛选发现具有放氢功能的蓝藻约有1．00多种，但蓝藻产氢的研究却主要集中在鱼腥藻和藻上。Hall等对蓝藻进行了广泛的筛选，获得的单细胞固氮蓝藻Synachoccoccas sp．Miami BG043511，产氢能力较高。Tsygankov等筛选到一株含有钒固氮酶的自养野生藻种A.bariabilis ATCC29413，在氩气环境下，以逐步加强光照的方式培养，其产氢速率经计算可达到61％的光合成放氧的速率；其不含氢酶的突变体PK84则可在富CO2环境下产氢，产氢速率为光合成放氧速率的33％。