纤维素酶水解过程分三步：纤维素酶在纤维素表面的吸附、纤维素的水解和酶的解吸。水解过程中纤维索酶的活性降低，这种钝化作用一部分是由于纤维素酶对纤维素的不可逆吸附造成的。在纤维素酶水解过程中添加表面活性剂，如Tween 80、聚乙二醇等，能够改变纤维素的表面特性，减少纤维素酶对纤维素的不可逆吸附。纤维素底物浓度是影响酶法水解得率和初始速度的主要因素之一。纤维素酶对纤维素底物的敏感度由底物的结构特征决定，包括纤维素结晶度、聚合度、表面积及木素含量。其中，木素通过阻碍纤维素酶到达纤维素及不可逆地结合水解酶来干扰水解，因此脱除木素能显著提高水解速度。纤维素酶活性主要受纤维二糖抑制，葡萄糖对其也有轻微的抑制作用。目前已经研究了几种减少抑制作用的方法，包括提高酶的浓度、水解中增加葡萄糖苷酶、通过超滤或者同时糖化发酵法脱除糖。
不同微生物组成的纤维素酶混合酶，或纤维素酶和其他酶混合因在水解过程中有协同作用，受到广泛研究。在木霉系统中添加β-葡萄糖苷酶比不添加β-葡萄糖苷酶的糖化作用好。半纤维素酶或果胶酶与纤维素酶混合可以显著提高纤维素转化率。Celluclast和Novozym混合纤维素酶处理经蒸汽爆破预处理的桉木树枝几乎能获得完全的糖化作用。
3.发酵法制燃料乙醇的化学原理
自然界很多微生物(酵母菌、细菌、霉菌等)都能在无氧的条件下利用糖酵解途径获取能量，并产生不同的发酵产物。从生产酒精的目的看，以酵母菌和少数细菌的发酵途径最有利，它们利用葡萄糖，发酵产物只有乙醇和CO2，这种发酵过程可用式(4-19)表示：
C6H12O62CH3CH2OH+2CO2(4-19)
在这种情况下，100g葡萄糖发酵得51．1g乙醇和48．9g CO2。因1mol固体葡萄糖燃烧可放热2．816MJ，而1mol乙醇燃烧可放热1．371MJ，故理论上通过发酵可回收97％以上的能量。实际发酵中乙醇收率必小于理论值，这主要由于以下一些原因。
①微生物不能把糖全部转化为酒精，总有一些残糖。
②微生物本身生长繁殖需消耗部分糖，构成其细胞体。
③杂菌的存在会消耗一些糖和酒精。
④发酵中产生的CO2逸出时会带走一些乙醇，因为酒精易挥发。
半纤维素构成了生物质的相当部分，其水解产物为以木糖为主的五碳糖，故五碳糖的利用是决定生物质燃料乙醇经济性的重要因素。一般的酿酒酵母不能发酵木糖和阿拉伯糖。自20世纪80年代初起，人们开始重视五碳糖的发酵。研究者通过三个不同的途径进行了探索，都取得了一定的进展。第一种方法是用木糖异构酶将木糖异构成木酮糖，经木酮糖激酶作用转化为木酮糖-5-磷酸，被酵母利用。也可以通过同时引入木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，将木糖先转化为木酮糖。由于一般木糖异构酶在pH值7～9时活性最强，而木酮糖发酵适于在酸性条件下进行，已筛选出了特殊的菌种，其产生的木糖异构酶在pH值为5的环境中也有活性。不过总的来说，这种方法的效率还不够高。第二种方法是寻找和驯化能发酵五碳糖的天然微生物。人们已经找到了很多具有这样能力的菌种，有的野生酵母还有较高的乙醇产率。但它们往往不能满足其他方面的要求，难以适应大规模工业应用。目前最有希望的是第三种方法，即用基因工程技术构建能发酵五碳糖的微生物。
木糖转化为乙醇的化学计量关系可用式(4—20)表示：
3C5H10O5CH3CH2OH+5CO2(4-20)
故100g木糖发酵同样可得51．1g乙醇。
4.燃料乙醇的发酵工艺
燃料乙醇的发酵工艺有直接发酵法、间接发酵法、混合菌种发酵、同时糖化发酵法和非等温同时糖化发酵法等。
直接发酵法利用纤维分解细菌直接发酵纤维素生产乙醇，不需要经过酸解或酶解前处理过程。吕福英等分离出能发酵纤维素生产乙醇的高纯富集物，直接将木质纤维素材料发酵成乙醇。该工艺方法设备简单，成本低廉；但乙醇产率不高，以稻草、麦秆为唯一碳源时，最高乙醇浓度分别为0．257g／L和0．129g／L，且产生有机酸等副产物。利用混合菌直接发酵，可部分解决这些问题。
间接发酵法先用纤维素酶水解纤维素为糖，再经发酵获得乙醇。
混合菌种发酵法是指应用多种微生物，在发酵过程中同时利用木质纤维素水解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等单糖和寡糖混合物的发酵工艺。杨斌等针对多碳源发酵乙醇的菌株不多，工艺及设备满足代谢上有一定困难，碳源利用率低，酒精产率低等问题，提出了采用气升柱发酵木糖和溢流柱发酵葡萄糖的串联发酵工艺。
将纤维素的酶水解和糖化产物发酵过程在同一装置内连续进行，由于水解产物由菌体的不断发酵而被利用，消除了葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用，这种工艺称为同时糖化发酵法(SSF法)。同时糖化发酵法简化了设备，节约了总生产时间，提高了生产效率，但也存在一些制约因素，如木糖的抑制作用、糖化和发酵温度不协调等。因此，Wu等提出了非等温同时糖化发酵法的工艺流程，以解决糖化和发酵温度不协调的问题。
发酵微生物的自身特性是影响发酵法制燃料乙醇的主要因素，另外，发酵条件，如温度、酸碱度、溶氧浓度等，发酵工艺和设备等对乙醇发酵也有重要影响。值得注意的是，末端产物乙醇对发酵过程存在明显的抑制作用。筛选耐较高乙醇浓度的微生物可以部分解决产物抑制的问题，但更多的是完善工艺条件不断地从发酵罐中将乙醇移出，采取的方法有：减压发酵法、快速发酵法。增加发酵器内酵母的细胞密度可提高发酵效率。细胞循环和固定细胞发酵是两种常用增加细胞密度的方法。对于能絮凝的酵母可用沉淀的方法达到循环。固定细胞发酵可使发酵器内酵母细胞密度增加，并能多次重复使用，减少了酵母繁殖成本。通常是把活体酵母固定在多孔的支持物上或吸附在固体表面上，把酵母细胞固定在中空纤维的方法也有报道。
三、生物质燃料乙醇的最新进展
1.获取可代谢糖源的新进展
将纤维素和半纤维素高效转化为可代谢碳水化合物不仅是燃料乙醇生产中的关键步骤，也是综合利用生物质资源所面临的重大研究课题。
稀酸水解是目前将纤维素和半纤维素转化为糖类物质的常规方法。由于木质纤维素结构复杂，含有一定量的果胶质、色素和酚类化合物等，当采用高温／化学试剂等剧烈方式处理，水解产物中除糖外，还会产生其他副产物，如有机酸、糠醛和羟甲基糠醛、芳香醇等。这些副产物对后续生物转化过程中细胞生长和目标产物生物合成会产生强烈的抑制作用，降低发酵效率。由于目前对这些抑制因子还缺乏清晰的理性认识，多探索性地采用一些技术方法来部分去除之，以减轻对后续发酵过程的影响。面对木质纤维素水解物中抑制物的负面效应，一般可以采取下列措施：①采用较温和的水解方式，如在蒸汽处理时加入SO2可以减少抑制物的形成；②进行化学脱毒处理；③适当的发酵条件，如采用分批发酵；④酶法脱毒，例如利用酚氧化酶(如漆酶)进行脱毒处理；⑤采用对抑制物有耐受性的菌株。
稀酸水解形成对发酵有抑制作用的化合物可以分为酸类(乙酸、阿魏酸、香草酸等)、醛类(糠醛、羟甲基糠醛、丁香醛等)、醇类化合物(松柏醇、香兰醇、愈创木酚等)，各种化合物抑制的机制是不相同的，取决于抑制物的化学结构。例如体外实验证实，糠醛可以抑制糖酵解酶活性，并影响醛脱氢酶活性，从而引起乙醛的积累，所以当存在呋喃时，酿酒酵母出现了较长的延滞期。糠醛(4g／L)可以严重降低特异的生长速率，但当它还原为糠醇时，抑制效果就会降低；可是糠醛转变为糠醇会影响细胞间的氧化一还原平衡。羟甲基糠醛比糠醛的抑制作用弱，但由于其转化速度慢，所以在培养基中的存在时间比糠醛长4倍。因此，从木质纤维素生物质化学组成和合成代谢途径分析的角度来研究这些抑制因子的种类及产生的过程机理，将有助于在过程设计中减少其生成或采用高效技术手段经济地去除之。
酶水解是目前降解木质纤维素研究的热点。该纤维素酶粉在pH=5．2、40℃下作用于花生壳直接生成葡萄糖，在2h内葡萄糖的生成量与反应时间成正比关系，然后逐渐缓慢；随着酶浓度的增大，葡萄糖的量也呈直线上升，说明从福寿螺分离得到的纤维素酶能有效地水解花生壳转化为可被利用的葡萄糖。
2.燃料乙醇发酵工程的最新进展
木糖利用是生物质燃料乙醇研究的热点之一。木聚糖酶基因相连得到的杂合体，利用这个重组系在发酵木质纤维素生产乙醇时有两个步骤：首先将收集到的具有木聚糖酶的细胞在60℃下加入到木聚糖溶液中糖化；然后再使反应器冷却至30℃发酵生成乙醇。最终的乙醇浓度最高可达56g／L。Yorrlalo等得到的基因工程菌大肠杆菌能有效利用木质纤维素水解得到的所有糖发酵生产乙醇，但是缺乏高的乙醇耐受性。
最近，专家们研究了水解过程中纤维素酶和p葡糖苷酶的动力学特征，发现它们的动力学参数比较符合SSF的偶联发酵模型。在35℃～45℃温度范围中，采用数学模型和计算机模拟对每一个温度下的动力学参数进行了估计。得出在起始时采用较低的温度(35℃)有利于细胞的生长，而10h后迅速升温至39℃，然后再慢慢地降至36℃。在这个NSSF中，乙醇的最高产率可达14．87g／L。
固定化细胞发酵具有能使发酵器内细胞浓度提高，细胞可连续使用，最终发酵液乙醇浓度高等优点。研究最多的是S.cerevisiae和Z.mobilis的固定化。常用载体有：海藻酸钙、卡拉胶、多孔玻璃等。研究结果表明，固定化运动发酵单胞菌比酵母更具优越性。最近又有将微生物固定在气液界面上进行发酵的研究报道，微生物活性比固定在固体介质上高。固定化细胞的新动向是混合固定化细胞发酵，如酵母与纤维二糖酶一起固定化，将纤维二糖基质转换成乙醇，此法引人注目，被看作纤维素原料生产乙醇的重要阶段。邓旭等提出了利用固定化啤酒酵母和固定化毕赤酵母串联发酵混合糖制取酒精的新工艺。该工艺实现了发酵过程的连续化操作，又消除了葡萄糖效应对木糖发酵的影响，保证了木糖发酵与葡萄糖发酵在串联流程中的同步性，从而大大缩短了混合糖发酵的周期，保证了整体发酵速率。同时，在前面的基础上，他们还对固定化啤酒酵母和固定化毕赤酵母在两个串联的固定床内连续发酵由葡萄糖和木糖组成的混合糖制取乙醇的过程，建立了连续发酵的非结构动力学模型，并成功地引入了一个综合考虑颗粒相内外传质总有效因子的简化模型。
但是传统的固定化细胞技术均使用各种载体材料，以包埋、吸附、交联等方式实现细胞固定化，载体材料的使用随之带来了许多细胞生理、生态、工艺、工程和经济方面的问题。
因此，Atkinson提出了利用某些微生物细胞的自絮凝作用而形成的颗粒作为一种固定化细胞的方法。它具有方法简单、过程经济的突出优点，而且反应器中无载体充填，可以获得更高的菌体浓度，进而强化反应器的设备生产强度指标。
白凤武等以酵母细胞自絮凝形成颗粒作为固定化细胞方法实现酒精连续发酵，并开发研制了悬浮床生物反应器。该反应器利用气升环流的原理，使絮凝颗粒酵母与基质问呈均匀悬浮。并在冷模研究的基础上，建立了有效容积500L中试规模的装置，研究了这种真实发酵物系的流体力学特殊性。
四、生物质燃料乙醇展望
随着世界石油、天然气源的日益枯竭以及它们的生产对地球生态环境的恶劣影响，迫使人们去开发新的能源。由于木质纤维素生物质是潜在的可再生资源，它将是人类未来的能量、食物和化工原料的主要来源。利用木质纤维素生产燃料乙醇不仅可缓解能源资源危机，也将对能源环境问题做出贡献，具有广阔的前景和应用价值。近年来，纤维素酶基因克隆技术、固定化技术、微生物发酵和代谢工程技术的应用，利用木质纤维素生产乙醇的技术已基本成熟。
目前最关键的问题是纤维素酶的成本太高，生产过程能耗偏高，生物质燃料乙醇的价格无法与粮食乙醇相竞争。因此还要加强对以下技术的研究：①以基因工程手段选育高产纤维素酶、木素酶菌种；②进行固体发酵技术的研究，解决目前存在的污染率高和成本高的问题；③进一步研究纤维素原料的预处理、酶水解及水解发酵生产乙醇等技术，以有效地降低生产成本；④开发低能耗乙醇回收技术。
(第五节 )生物制氢
一、概述
1.引言
氢是一种高效、洁净的可再生能源。随着能源与环境问题日趋严重，氢能的研究和利用也日益受到重视。早在1977年，联合国国际能源局(IEA)组织了由多个发达国家参与的“氢能执行合约”(hydrogen implementing greement)，将氢能的研究推向国际化，其战略目标是在21世纪开创“氢能经济”的新时代。20世纪90年代以来，氢能研究在世界各国受到格外的重视。美国在1990年通过了SparkM．Matsunaga氢能研究与发展、示范法案。根据该法案，美国能源部(DOE)启动了一系列氢能研究项目，并成立了氢能技术顾问团(HTAP)。1996年，美国又通过了未来氢能法规(hydrogm futureact)，决定在1996～2001年间再投资16450万美元，用于包括氢的生产、储运和应用的研究、开发和展示。2003年又批准了Freedom cAR(cooperative autonlotive redearch)和fuel initiative计划，总投资12亿美元，其中7．2亿美元用于氢能生产、储运和分配所需的技术基础设施。日本通产省于1993年启动了WE-NET项目，计划2020年前共投入30亿美元开发氢能系统的关键技术。欧共体主要国家也均有相应的氢能发展计划。