1940年10月，国民党政府停止供给八路军军饷。19日，国民党军委会总参谋长何应钦、副总参谋长白崇禧“电令”朱德、彭德怀及新四军军长叶挺，强令黄河以南的八路军、新四军于一个月内全部开赴黄河以北。为了顾全大局，中共中央表示江南正规部队可以北移。12月9日，蒋介石再次电令江南新四军于12月底前开至长江北部。与此同时，国民党蒋介石的“剿灭黄河以南匪军计划”和“解决江南新四军”等方案已经制定，调集第三、第五战区主力8万余人的兵力，于1941年1月5日将转移到达皖南茂林地区的新四军军部及主力部队9000余人团团包围并发动袭击。我新四军被迫还击，血战七昼夜，终因弹绝粮尽和敌我力量悬殊太大，除2000余人突围外，其余大部分壮烈牺牲。军长叶挺被借谈判之名扣押，副军长项英和参谋长周子昆于突围时被叛徒杀害。17日，蒋介石宣布新四军为“叛军”，并取消新四军番号。第二次反共进入高潮。
皖南事变发生后，中共中央立即进行了强有力的反击。1月20日，中央军委发出重建新四军军部的命令。22日，毛泽东在《为皖南事变发表的命令和谈话》中揭露了国民党的这一罪行。并号召全国人民提高警惕，与反动派作坚决斗争，要求国民党当局取消1月17日的反动命令，释放叶挺等新四军被俘人员。在重庆领导南方局工作的周恩来，在《新华日报》稿件被扣的情况下，用“开天窗”的形式同国民党作针锋相对的斗争。国统区的爱国人士及海外华侨也群起指责蒋介石这一罪行。由于中国共产党采取了一系列积极措施，另外迫于海内外舆论的强大压力，国民党进行反共分裂的阴谋不得不有所收敛。1941年3月，国民党第二次反共高潮被击退。