泥鳅一般1冬龄性成熟，属多次性产卵鱼类。长江流域泥鳅生殖季节在4月下旬，水温达18℃以上时开始，直至8月份，产卵期较长。盛产期在5月下旬至6月下旬。每次产卵所需时间也长，一般4～7天时间才能排卵结束。
泥鳅怀卵量因个体大小而有差别，卵径约1毫米，吸水后膨胀达1.3毫米，一般怀卵8000粒左右，少的仅几百粒，多的达十几万粒。体长12～15厘米的泥鳅怀卵1万～1.5万粒；体长20厘米的泥鳅怀卵的达2.4万粒以上。体长9.4～11.5厘米的雄性泥鳅精巢内含约6亿个精子。雄泥鳅体长达6厘米左右时便已性成熟。成熟群体中往往雌泥鳅比例大。
泥鳅常选择有清水流的浅滩，如水田、池沼、沟港等作为产卵场。发情时常有数尾雄泥鳅追逐一尾雌泥鳅，并不断用嘴吸吻雌鳅头、胸部位，最后由一尾雄鳅拦腰环绕挤压雌鳅。雌鳅经如此刺激便激发排卵，雄鳅排精。这一动作能反复多次。产卵活动往往在雨后、夜间或凌晨。受精卵具弱黏性，黄色半透明，可黏附在水草、石块上。一般在水温19℃～24℃时经2天孵出鳅苗。
刚孵出的鳅苗长约3.5毫米，身体透明呈“痘点”状，吻端具黏着器，附着在杂草和其他物体上。约经8小时，色素出现，体表渐转黑色，鳃丝在鳃盖外，成为外鳃。3天后卵黄囊接近消失，开始摄食生长。经20多天，苗长15毫米，此时的形态与成鳅相似，呼吸功能也从专以鳃呼吸转为兼营肠呼吸了。