发菌室是白灵菇生长菌丝的场所，要求干燥（空气相对湿度在70％以下），容易保温，便于通风，一般不需光线。有条件的要在室内设架子，把菌袋放在架子上发菌。
发菌室以平房为最好，保温好，容易消毒。每平方米放配制装好的菌袋约50个。但在生产实践中，由于生产量大，不可能有那么多平房供使用，一般是将出菇用的日光温室也作发菌室使用，每亩日光温室可放湿重为1千克的菌袋3．5万~4万个，冬季气温低时可放菌袋5万～6万个。日光温室作发菌场所使用，由于温度不易控制，和平房相比，往往会拖长发菌时间，此期应注意管理，加强控温和通风工作。