1941年1月11日，周恩来正在化龙桥虎头岩出席《新华日报》创刊3周年的庆祝活动。中共南方局机要员急匆匆地送来一份急电：皖南新四军在北移途中被包围袭击了。周恩来向大家宣布了国民党发动皖南事变的消息，并谴责了国民党顽固派的阴谋。这时，大厅里的电灯突然熄灭，屋子里一片漆黑。过了一会儿，电灯又亮了。周恩来鼓励大家说：“有革命斗争经验的人都懂得怎样在光明和黑暗中奋斗，不但遇着光明不骄傲，主要是遇着黑暗不灰心丧气，只要大家坚持信念，不顾艰难向前奋斗，并且在黑暗中显示英勇卓绝的战斗精神，胜利是会到来的，黑暗是必然被击破的。”
1月17日晚，国民党政府军事委员会“以皖南新四军违抗命令，不听调动；不按指定路线由铜、繁一带步移，而经泾县南袭击友军为借口，发布撤销新四军番号、将叶挺移交军事法庭审判的通令和谈话。”国民党政府军事委员会声称：据第三战区司令长官顾祝同来电说：国民革命军新编第四军违抗命令，不遵调遣，自上月以来，在江南地区，集中全军，蓄意扰乱战局，破坏抗日阵线，阴谋不轨，已非一日，本月初，自泾县潜向南移，竟于4日，胆敢进攻我前方抗日军队阵地……我前方被袭各部队，对此不测之叛变，若不忍痛反击，前线各军之将士，无以自卫……职为应付危急，不得不为紧急处置……兹已将该新编第四军全部解散，编遣完毕，该军军长叶挺于当日就地擒获，该军副军长项英潜逃不获，正在饬部严缉归案……该新编第四军抗命叛变，逆迹昭彰，若不严行惩处，何以完成国民革命军抗战之使命，着将国民革命军新编第四军番号撤销，该军军长叶挺着即革职，交军法审判，依法惩治，副军长项英着即通令各军严缉归案讯办，藉伸军纪，而利抗战。特此通令。
周恩来得知国民政府军事委员会发布的通令和谈话后，立即向国民党谈判代表张冲和国民党政府参谋长何应钦提出抗议，并在电话里愤怒斥责何应钦：“你们的行为，使亲者痛，仇者快，你们做了日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人。”连夜，周恩来为《新华日报》写了悼念皖南事变死难烈士的题词和挽联，这就是“为江南死国难者志哀”和“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急！！”他指示《新华日报》以抗议国民党新闻检查的办法发表，并亲自布置使报纸如何突破国民党封锁的工作，以便赶在重庆其他报纸出版之前将《新华日报》发出去。报社将题词刻成木版后，立即拼版，快速印刷。天亮前把印好的报纸放进铺盖里，装入箩筐，从红岩后山偷运进城。当国民党特务发现报纸上有周恩来的题词时，《新华日报》已经传遍了整个山城。
18日下午，《新华日报》许多卖报的人员遭到国民党特务、警察、宪兵的殴打和关押，就连报馆的营业部主任也未能幸免。当时，周恩来同国民党代表张冲正好在《新华日报》营业部，他获悉这一消息后当场向张冲提出严重抗议，要求国民党方面立即释放被关押的人员。国民党警察和宪兵不得不释放了这些人员。为了动员各方力量，揭露内战分裂危机，制止国民党顽固派的反共投降活动，周恩来组织中共南方局和《新华日报》社的干部，向国民党内部的抗战派和元老派、各民主党派、新闻界、文化界、工商界，以及外国记者和外交人员，宣传皖南事变真相，抗议国民党顽固派的反共罪行。
为研究如何驳斥国民党顽固派对新四军的造谣和污蔑，1月18日下午，叶剑英主持召开会议进行讨论。参加讨论的有李涛、边章五、薛子正、傅大庆、雷英夫、徐冰、陈家康、章汉夫等。针对国民党政府军事委员会通令和谈话对新四军的污蔑，会议列出8个问题，以具体事实给予回击。会后，指定南方局军事组成员将会议讨论的结果整理成文章。第二天凌晨，他们写出长达6000余字的《新四军皖南部队惨被“围歼”真相》一文。周恩来审阅后提出了具体的修改意见，并指示以传单的形式秘密散发。19日上午，《新华日报》印好了这篇文章，南方局和《新华日报》的同志将其散发出去。
文章说，江南惨变，亲痛仇快，而军事委员会通令与其发言人及重庆中央、扫荡、益世、商务、时事各报纸对新四军任意污蔑，曲解事实，混淆听闻，即使较公正的报纸在议论统治下，也不能揭露阴谋，发表公论，以致黑白难明。为使国人能明白事变真相，揭露内战阴谋，以挽救目前严重危局起见，特选择有关重大问题，分别记明如下：（1）关于所谓新四军违反命令不受调遣的问题；（2）关于新四军渡江路线问题；（3）关于新四军移动时间问题；（4）所谓“借端要索”问题；（5）究竟谁打谁的问题；（6）所谓要在江南建立根据地的问题；（7）叶、项正副军长与新四军部队；（8）取消番号与审判军长。文章对所列的8个问题一一给予了答复。
1月18日，刘少奇发布《关于驳斥国民党顽固派发动皖南事变借口的通报》，对国民党政府军事委员会取消新四军番号的所谓理由进行驳斥。他指出，关于新四军遵命北移问题，叶挺曾亲自赴上饶谒见顾祝同及上官云相，请示北移机宜，并请求拨发经费。曾派政治部黄秘书长携函向皖南邓专员、五十二师、一○八师、四十师、六十三师、挺进军及冷欣等说明我军奉命北移，并接洽沿途事宜。军部在11月、12月间，曾不断召开干部会议解释北移意义，还召开当地士绅和民众会议，发表告别民众书。自12月初，军部行李及直属机关人员与长官家属分批陆续由苏南渡江北上。关于新四军不走铜、繁而走泾南的原因：（1）国民党事先已经宣传我军北上，以致日寇在铜、繁之间严密封锁；（2）李品仙3个师开至江边无为、庐江一带，扣留船只，控制渡口，不容我通过；（3）军部以万人之众，不能在敌人据点附近行动，必须在离敌人较远的地方通过，所以不能在泾县以北渡过青弋江，而必须经茂林、宁国向苏南转移；（4）泾县以南青弋江有较浅的地方可以徒涉；（5）第三战区要新四军到宁国一带领取子弹和经费；（6）蒋介石和第三战区指定的路线有两条，一条经铜、繁，一条经苏南北上，并没有一定的限制。刘少奇还声明，国民党说新四军首先袭击其军队，这是捏造。我军完全按命令进行布置及分批北移，哪里有在皖南进攻国民党军队的道理。如果新四军企图进攻国民党军队，则决不会事先毫无准备以致全军覆没。
同一天，刘少奇就收容皖南事变失散人员建立游击根据地等问题致信罗炳辉：（1）皖南失散武装人员，望派人尽量收容，在芜湖附近，铜陵、繁昌一带打游击，建立根据地与民主政权；（2）在宁国、泾县之间的部队，如能到天目山，并估计在天目山能够立足，即到天目山打游击，建立游击据点。如果路上难以通过，或在天目山不能立足，即设法到铜陵、繁昌一带打游击，或暂时上山，掩护旗帜，借以保存力量，待机行动。
同时，刘少奇、陈毅向中共中央报告，建议在苏北成立新四军军部，陈毅代理军长。
国民党政府军事委员会发布“撤销新四军番号”的命令，使国共关系变得更加紧张。中共中央认为，国共关系开始破裂，“蒋介石已经将我们推到和他完全对立的地位”，“现在这样的国共关系，已对我们、对革命没有任何利益”。于是，中共中央决定，将逐步撤销八路军、新四军在各地的办事处。针对当时的国共关系，中共中央指出，“在政治上取猛烈攻势，而军事上暂时还只能取守势，惟须作攻势的积极准备，以备在4个月或6个月后能够有力的转入攻势”。1月20日，毛泽东以中央军事委员会发言人名义发表谈话，揭露国民党当局的反共阴谋，抗议国民党军队对新四军的暴行，要求国民党以大局为重，取消1月17日的反动命令，惩办祸首，释放叶挺，废止国民党一党专政，实行民主政治。谈话发给了国民党中央社、蒋介石、香港、上海等地。中共中央提出中国共产党关于解决皖南事变的12条办法：第一，悬崖勒马，停止挑衅；第二，取消1月17日的反动命令，并宣布自己是完全错了；第三，惩办皖南事变的祸首何应钦、顾祝同、上官云相3人；第四，恢复叶挺自由，继续充当新四军军长；第五，交还皖南新四军全部人枪；第六，抚恤皖南新四军全部伤亡将士；第七，撤退华中的“剿共”军；第八，平毁西北的封锁线；第九，释放全国一切被捕的爱国政治犯；第十，废止一党专政，实行民主政治；第十一，实行三民主义，服从《总理遗嘱》； 第十二，逮捕各亲日派首领，交付国法审判。1月25日，周恩来将这个12条交给国民党代表张冲由他转交蒋介石。在毛泽东发表谈话的当天，中央军委总政治部就皖南事变后八路军、新四军紧急工作发出指示，认为“大地主大资产阶级当局已决心与共产党分裂，皖南事变与1月17日国民政府军事委员会的命令，便是这个分裂的开端”。在这严重局势下，八路军、新四军必须做好以下紧急工作：（1）根据中央指示在我军干部、党员和战士中进行解释，以做好思想上精神上的准备；（2）巩固我党领导的50万大军，这是决定今后胜利的第一等重要的任务；（3）要反对“一走了事”的观念，一部分主力的移动，要求我们尽最大的努力坚持原地区；（4）要继续坚持统一战线政策，反对“左”的倾向。
与此同时，中共中央军事委员会发布重建新四军军部的命令，任命陈毅代理军长，刘少奇为政治委员，张云逸为副军长，赖传珠为参谋长，邓子恢为政治部主任。1月25日，新四军军部在苏北盐城成立，并将新四军整编为7个师、1个独立旅。粟裕为第一师师长，张云逸为第二师师长，黄克诚为第三师师长，彭雪枫为第四师师长，李先念为第五师师长，谭震林为第六师师长，张鼎丞为第七师师长，梁兴初为独立旅旅长。
1月25日，毛泽东致电周恩来，认为对蒋介石应采取不怕破裂的态度。他说，人家已经宣布我们“叛变”，我们决不能再取游移态度，我们决不能再容忍，我们决不怕破裂，否则，我们就要犯严重错误。“你们应向各方表示，蒋介石已将我们推到对立地位，除非蒋介石取消17号命令及实行其他必要步骤”。当天，中共中央致电周恩来，提出对付蒋介石“一·一七”命令的方针：（1）为了对抗蒋介石1月17日的步骤，我们必须采取尖锐对立的步骤回答他，否则不但不能团结全国人民，不能团结我党我军，而且还会中蒋介石的诡计；（2）延安命令及谈话仅为对付蒋介石1月17日步骤，待蒋采取其它步骤时，我们再采取新的步骤；（3）我们的让步阶段已经完结，我们必须准备对付全面破裂；（4）政治上取全面攻势，军事上取守势；（5）你们必须立即向国民党表示，如果他们不能执行我们所提的12条，你们应立即离开。
出乎蒋介石的意料，就在他发布1月17日通令和谈话后不久，日军调集 7个师团的兵力在河南发动大规模进攻，将汤恩伯等部 15万人包围在平汉铁路以东。蒋介石原打算以反共来制止日军的进攻，没想到事与愿违。日军乘国民党制造皖南事变引起国共冲突之际发起进攻，以进一步削弱中国的军事力量。另外，蒋介石企图把八路军、新四军都赶往河北，这是日本人不愿看到的。日本人认为，华北是他们的根据地，蒋介石把共产党的军队赶到华北，就是破坏日本利益。日军的进攻对蒋介石是一个沉重打击，这迫使蒋介石不得不采取和缓的步骤。
毛泽东敏锐地观察到了蒋介石的变化，2月7日，他致电周恩来：依我观察，他们非求得个妥协办法不可。敌人攻得如此之急，“一·一七”命令如此丧失人心，他的计划全部破产，参政会又快要开了，非想个妥协办法更加于他不利。这样，双方斗争焦点就转到中国共产党人是不是出席第二届国民参政会的问题上来。1940年12月23日， 第二届国民参政会的参政员名单已经公布。中国共产党方面的参政员有毛泽东、董必武、邓颖超等7人。各民主党派和无党派人士纷纷表示：国民参政会开会，中共参政员的出席是必不可少的。美国总统罗斯福的代表居里也留在重庆不走，据说是专等观光国民参政会开会的。蒋介石非常焦灼，他急于想把共产党人拉进国民参政会来，以减轻国内外对他的非难，以摆脱困境。在这种情况下，共产党不可能无条件地参加会议。
2月18日，周恩来将中共方面7位参政员致国民参政会的一封公函递交给参政会秘书长王世杰，声明中共所提12条善后办法未裁夺之前，中共参政员碍难出席。张冲多次找周恩来，希望收回这封公函。但周恩来表示，公函不能撤回。就这样，中共参政员拒绝出席参政会。这一举动给蒋介石造成很大压力，他开始缓和气氛。3月14日，蒋介石约见周恩来，他表示，只要听命令，一切都好说，军队多一点，军饷要多一点，好说。3月25日，宋美龄宴请周恩来夫妇，蒋介石、张冲在座。对于这次见面，周恩来向中共中央报告说：“只是表面上的轻微缓和，实际上要看他是否真正做些缓和的事。”此后，国共关系趋向一定的缓和。
国民党的反共反人民的行为遭到了全国人民的反对，许多地方举行了声势浩大的示威游行和各种抗议活动，谴责蒋介石的反动行为，有力地震慑了蒋介石的反动行为。