李时珍立志重修本草学著作的构想在脑海里酝酿过千百回，他翻阅过古代的大量药书，他多次征求过父亲的意见。他创览了一批与医药学无关的经史典籍。
从朱熹在《通鉴纲目》中所采用的“以纲挚目”、“纲举目张”的编辑方法实为学界的一大创新，读者看起来非常方便。他当即决定将自己酝酿已久的本草学著作定名为“本草纲目”，这四个大字。他怀着极大的热情耐心整理，分门别类地编辑以往收集的大量资料。
李时珍在编著《本草纲目》的过程中逐渐发现不少问题，他父亲李言闻提醒他要到大自然中直接去观察才会有真知灼见，并以自己写作《蕲艾传》的经历启发李时珍。
李言闻写完《蕲艾传》后由于身体状况欠佳难以继续著述，就把这项心愿托付给了李时珍，让他撰写《蕲蛇传》。李时珍从药贩子那里见到了“蕲蛇”，并照样做了一些笔录。后来有位知情者告诉他药贩子所收的蕲蛇不全是真的，要想看真的白花蛇最好亲自到产蛇的龙峰山去。李时珍不辞辛苦、不怕危险多次登上龙峰山，亲眼见到了珍奇的白花蛇。这种蛇头大、嘴长、略扁，长有4颗长牙，身体黑质白花，胁下有24个斜方块花纹，“其走如飞，牙利而毒”，经常咬伤人脚。因为其毒性特大，一旦有人被咬伤后必须立即截肢，否则就会丧命。不过这种蛇的药用价值也很大，能治小儿抽搐、破伤风、半身不遂、关节炎、白癜风、浑身瘙痒等疑难病症，所以州府官员经常拿它作为贡品进献朝廷，以便邀功请赏。
李时珍设法搞到了几条白花蛇，根据医书和偏方把它制成了“濒湖白花蛇酒”、“世传白花蛇酒”、“瑞竹白花蛇酒”、“鸡峰白花蛇膏”、“治癫白花蛇膏”、“祛风膏”、“洁古白花蛇散”、“三团白花蛇散”、“托痘花蛇散”、“总录白花蛇散”、“三蛇愈风丹”、“俗传白花蛇丸”等药，并把这些研究成果写成了《白花蛇传》，即人们通常所说的《蕲蛇传》。这部书是李时珍迁居红花园之前完成的，写得非常成功。
李时珍移居雨湖北岸的红花园之后不久，其父李言闻不幸病逝。李时珍万分悲哀，脑海里时常浮现出慈父的身影。为了早日从痛苦中解脱出来，抓紧时间进行著述，李时珍毅然走出家门。
李时珍深知自己的小小失误或粗心大意都可能给病人造成不应有的恶果，他在著述《本草纲目》的过程当中又进行了长期的实地考察，核对和检验脱手的那部分药书草稿中的错误和不当之处，补充以往的缺憾和不足。
他本着“由近及远、由浅入深”的原则反复考察新州一带的山山水水。从近处的缺齿山到远处的丫头山，从宏大的紫云洞到窄小的朱家洞，都留下了李时珍艰苦跋涉的足迹。他对山水中的所有动植物都进行了细致的观察。
他不管遇到什么样的人，都经常开口问清楚，随时将有价值的记录下来。
周围的人听说他正在收集材料撰写药书，都把掌握的知识学给他听。左邻右舍的男女老少还热情为他提供实物样品和有关生活实践知识。
为了使自己的医术得到继承和传播，更为了抽出更多的时间悉心写书，李时珍在新州本地收留了一位徒弟。
此人姓庞，名宪，号鹿门，性格乖僻，少言寡语，但对医术肯于钻研。他在恩师李时珍的指导下精读了《灵柩》和《素问》等书，学会了李时珍诊治疾病的许多技艺，成为继李时珍之后斯州最有名的医生。就连《本草纲目》中也凝聚了他的一份心血。
李时珍深知要写出价值超前的传世之作，光立足于蕲州这块弹丸之地是绝对不行的。48岁的李时珍带着徒弟庞宪、儿子李建元一起各自背着药箱，从嘉靖四十四年1565年开始，告别蕲州，先后到江苏、安徽、江西、湖南、河南、河北和广东等省。李时珍不论走到哪里。
他访医问药，留心观察。
李时珍带着弟子庞宪等人应邀给一位渔民治病。事后渔民家留他们吃饭，席间上了一盘河豚肉，肉质细嫩，味道美极了。李时珍见景生情，马上想到“舍命吃河豚”
的谚语，领略了这句话的真切含义。闲聊时主人告诉他，吃豚油会使人舌头发麻，吃河豚籽会使人肚子发胀，吃河豚眼睛会使人眼睛发花，错误吃法还可使人送命。李时珍当即编了句顺口溜“油麻、籽胀、眼睛花”，告诫人们吃河豚时千万要谨慎，以防中毒。
李时珍的考察是全面而深刻的。他要留给后人的著作不仅仅是简单的成方，而是要详细叙述各种药材的生活习性、生长状况、人药方法、药用价值等，所以他的考察详细而入微。
李时珍知道穿山甲又叫“鲮鲤”，是一种珍贵的药材，可治多种妇科病，可他从未见过活的穿山甲，自然也就不知道它是如何捕食蚂蚁的。他在山民的协助下亲眼看到了穿山甲：形似鲤鱼，头如鼠，尖嘴，无牙，长舌头，鳞片较大，厚而坚硬，黑色，长有三角形的大尾巴，腹部有毛而无鳞甲。其捕食方法是靠嗅觉寻找蚂蚁洞，然后拱开蚁穴，将长舌头伸进去舔食蚂蚁。李时珍这些亲身经历，都记录到《本草纲目》之中。
李时珍外出考察了很多次，每次回乡总有一些病人慕名前来求医。其中绝大多数患者是药进病除，但也有特例。相传有位病人的病状十分特殊，李时珍不敢确诊，遂试探性地根据病情开了几味安全的药，非常诚恳地告诉病人再找别的大夫看一看。后来那位病人果然是靠吃了章大夫的药才治好病的。李时珍获悉后非但没有嫉妒贬低章大夫，反而化名为李壁，自称是江西瑞昌人氏，主动登门拜章大夫为师，潜心学习了半年之久才满载而归。
为把自己的著作写得科学、准确、全面、具体，力求至善完美。他走到哪里学到哪里，每到一处都要亲眼见识一下各地的特产药材，想方设法到制药作坊参观，学习制药的技艺。他收集了大量的极有价值的民谚*匝口溜和民间偏方。
李时珍有较高的鉴赏力，文才很好且擅长诗文，因而，他对各地的民谣民谚有一种特殊的兴趣，其中那些具有医药学价值的都被他写进了书里。如：“人老伯大寒”、“三分吃药，七分调理”、“冬忌生鱼，夏忌狗肉”、“大豆加甘草，解毒效果好”、“刀豆烧成渣，服后呢逆下”、“穿山甲，王不留，妇人吃了乳长流”、“若食半边莲，可伴毒蛇眠”、“胭脂草捣烂，可治虫咬伤”、“七叶一枝花，深山是我家。李时珍不论何时何地，也不管身体多么疲乏，他总是随时将自己的走访考察收获加以整理。嘉靖四十三年（1564年），长子李建中考中了举人，李时珍非常兴奋，情绪更加高涨，为完成自己的事业继续旅行，到庐山、茅山和牛首山等许多名山。就在他考察回归途中，听说嘉靖皇帝因服食金丹而毙命。新继位的明穆宗朱载豆下令大捕炼丹的方士，为父报仇。处决了一批方士，另有很多人受到连累。李时珍根本没有想到他已过世的父亲李言闻竟也受到了牵连，原因是父亲生前曾受道正柳道春之邀参加玄妙观的设计之务，现在却成了罪状。这是李时珍回到新州以后才知道，但他并没有因此而动摇自己的信念，更没有放弃自己，《本草纲目》的著述的追求。
李时珍从嘉靖三十一年（1552年）动笔到万历六年（1578年）定稿，前后经历了27个年头，再将考虑选题的时间也共计有30余年，著述《本草纲目》一书，正如李时珍本人所说：“岁历三十稔，书考八百余家，稿凡三易。”其子李建元在《进本草纲目疏》中亦讲：父亲“行年三十，力肆校雠，历岁七旬，功始成就”。
在这30年当中，李时珍忘我劳作，全身心地投入到《本草纲目》的著述上来，熬过了千百个不眠之夜，前后三易其稿，终于实现了他重修“本草学”的夙愿。
李时珍自从他打定主意重修“本草学”著作那天起，阅读了八百多部相关的书籍，抄录近百万字的资料，又行程万里，走访过数以千计的各界人士，考察核对过千百种药物，收集了大量的实物标本，著述《本草纲目》耗费了他大半生的精力。在即将成书的那些日子里，把弟子和儿女全部动员起来，帮助抄写书稿。整理资料，分类编辑，研讨疑误。
李时珍共有4个儿子。长子李建中（考中举人之后又多次参加进士考试，可惜榜上无名。李建中在明穆宗隆庆五年（1571年），出任河南光山县（今同）教谕，挂学官之职，后来迁升为四川蓬溪县（今同）知县。）次子李建元（考取黄州府府学的秀才之后便止步不前。）三子李建方（从父习医，是位通过太医院考选的合格“医士”。四子李建木智力一般，只考了个秀才。）李时珍此时已有5个孙子，年龄较大的李树宗、李树声、李树勋和李树本四人都各尽所能，帮助他分忧解难。抄写稿件，绘制画图，都付出了大量心血。《本草纲目》不仅是李时珍个人的辉煌业绩，也是他的弟子及李家老少团结协作的结晶。李时珍《本草纲目》完成于明朝万历六年（1578年）。61岁的他年过花甲，他的最大的愿望就是促成《本草纲目》一书流行于世。
李时珍编撰《本草纲目》的目的是要造福人类。为使《本草纲目》早日付梓，为了让广大民众掌握更多的医药知识，他又为该书的出版之事劳神费心。李时珍一辈子靠行医维持生活，自己没有经济实力刻印《本草纲目》，于是鼓足勇气向附近的乡绅提出了这一想法，但都被婉言谢绝。他有些气愤，可转念一想，写书又不是为了他们，没有必要跟他们赌气，本地不行还可以到外地另请高明。他把目标对准了出版业最兴盛的南京城（今同），那里书商多，经营规模大，刻工水平高。如果能在南京找到一家书坊合作，那才是求之不得的好事。李时珍万历七年（1579年），到了南京。
他在南京逗留了挺长时间，找不到对《本草纲目》感兴趣的书商，又借机去了南京附近的几个城市，并于万历八年（1580年）十月到太仓州（今江苏太仓）拜访了以前曾有过几面之交的王世贞。
此时王世贞已卸职在家养老，他热情接待了远道而来的李时珍。两位老人在王家的多山园畅谈了几天，从天文地理到声律农圃，从诗文创作到野鹤闲云，谈得非常投机。李时珍极为赞赏王世贞万历四年（1576年）前后所写的描述太和山美景的诗篇。王世贞也钦佩李时珍的才华及其人品，夸他为“真北斗以南一人”。（《本草纲目·序》）李时珍登门拜访的用意是想求王世贞为《本草纲目》写一篇序文，“愿乞一言，以托不朽”，借助王世贞的崇高声望来宣传《本草纲目》。王世贞接受了李时珍的请求，留下了李时珍带来的数十卷《本草纲目》的书稿。
王世贞万历十八（1590年），相隔10年终于为《本草纲目》写了一篇非常精彩的序，指出这部书“博而不繁，详而有要。综合究竟，直窥渊海”，读了这部书犹如走进“金谷园”和“龙君宫”，令人赞叹不已。他高度评价这部书是“实性理之精微，格物之通典，帝王之秘篆，臣民之重宝也”，从浅层上罗列了一些夸赞之词，并向书商推荐，倡导有识之士刻印、刊行这部医药学巨著。
王世贞的赞誉扩大了《本草纲目》的影响。南京书商胡承龙就在当年，从王世贞那里看到了这部书稿的抄本，认为这部书颇有应用和保存价值，必定受到社会的喜爱，应该流传给后世子孙，同时有利可图，又能捞取一定的名声，所以他决定出资刻印。