第二年，亨利二世在为两个女儿婚礼举行的马上比武中，负了致命的伤而死去，玛丽的丈夫弗兰茨在兰斯的大教堂加冕成为新国王，庆典仪式为了不与丧仪冲突，非常简朴。如此一来，玛丽成为了法国的女统治者。而此时她只是苏格兰名义上的国君。因为1554年，她把摄政权交予母亲，由她处理现实政治问题。、越来越多的苏格兰贵族倾向于新教，并于1557年公开结成定期集会和举行礼拜仪式的团体，他们当中有最富裕的领主们。分裂的后果是灾难性的。从这时起，天主教徒受到迫害。布道师约翰·诺克斯带着满脑子的加尔文教义，结束流亡生涯返回苏格兰，在最大的佩思天主教堂，发表了反天主教的充满火药味的演说。他特别攻击了法国在苏格兰宫廷里的影响。当天主教神父出现在这座自己的教堂时，事件最终发展成为一场暴乱。聚集起来的人群破坏并洗劫了这座天主教大教堂。这是一场遍及全国的起义开始的信号。当新教联盟的贵族们向英国求助时，女摄政玛丽·封·吉兹把她的士兵集合起来。
在英国，伊丽莎白一世，亨利八世的女儿，前不久刚刚开始执政。她对苏格兰采取一种两面派手法：表面上她宣布中立，暗地里却派兵送钱给苏格兰新教贵族。1560年春天，她死去的姐姐的丈夫，西班牙的菲利浦二世悄悄告诉她，说苏格兰女王和她的法国丈夫一心想废掉她时，她公开表态支持苏格兰新教贵族。西班牙国王所说的完全是个谎言，但玛丽·斯图亚特毕竟在秘密文件中（宫廷秘密总是为了被传扬出去而存在的）提出过对英国王位的要求。无论怎样，伊丽莎白一世相信了西班牙人。她签署了一个条约，条约保证向苏格兰贵族们在反对天主教徒和（“为了捍卫苏格兰的独立自主”）反对法国盟友的战斗中，提供军事和经济援助。内战以玛丽·斯图亚特失败而告终。她始终只是从使者们的报告中知道自己国内发生的战争的情形。1560年6月6日，法国的特命全权代表以她的名义与英国缔结和约，条约规定，她与弗兰茨二世放弃英国王冠。一个月后，苏格兰议会屈服于和约中的一个条件，颁发了一项法令，宣布脱离教皇并禁止臣民举行天主教的弥撒仪式。苏格兰被彻底新教化了。
玛丽，天主教徒，法兰西和苏格兰女王，在同一年成为寡妇。体弱多病的弗兰茨二世去世，年仅17岁。如今玛丽在法国应该做什么?在这儿，她的个性强硬的婆母，卡塔琳娜·封·梅迪契，拥有发言权。作为寡妇，她在这儿根本算不上什么。由于她母亲在几个月前正好逝世，最后的决定其实已经很清楚了：玛丽必须回去，宝座正空着!但她犹豫着，没有启程。苏格兰于她而言，已经变得陌生，与其说她是苏格兰人，不如说是法国人，现在的她一点儿也不了解她的臣民们的精神与气质。准备归程花了一年时间，这期间，她的继兄弟詹姆斯（詹姆斯五世与情妇玛格丽特·埃尔斯金私通所生之子）为他的妹妹管理着国家。
苏格兰国内各派之间的政治宗教鸿沟，会在玛丽统治下再度被填平了吗?玛丽断然拒绝了部分贵族敦促她改信新教的要求。对她个人而言，天主教是不可侵犯的。但她也准备作出让步。她接受新教作为官方的国教，正如1560年的议会决议决定的。然而她回避了正式批准这一法律，这样，她保留了将来也许对宗教问题作出另外决定的权利。她自己享有在家庭小教堂中举行天主教弥撒仪式的自由，而这在全国是明令禁止的。民众有理由满腹狐疑地等待玛丽回国。
如果玛丽改信新教，历史会发生什么样的转变?政治实用主义和理智的策略似乎都使她更容易采取这一行动，她最亲近的心腹们也如此催促她。但是她不为所动，坚定不移。“任何美丽的东西都不能持久，玫瑰与百合只能盛放一个春天：您的美丽也是如此，它只在法国闪亮了15年，然后突然消逝了”，诗人龙萨抱怨道。1561年8月15日，她的船在暴风中从加莱港起锚。在13年的异乡生活后，这个流亡者重新回到自己的国度。在苏格兰王座上
1561年8月20日，当回家的人清早在利思港停下返航的脚步时，苏格兰的海岸像往常一样，雾气沉沉。没人料到她会这么早抵港，无人在场迎接玛丽。当她到达的消息传到爱丁堡时，人们晦气地说，起雾是一个不祥的预兆。同样被她抵达的消息所震惊的詹姆斯匆忙上路前去迎接他的继妹。他带她来到爱丁堡，进入城墙边的圣十字架宫，在那儿，别人呈给她要签署的第一份公文，这是一份声明，在其中她许诺，不触犯苏格兰的任何法律。她毫不犹豫地签了名，她知道她所签署的条约和声明通常不值一文，形同废纸。
一个星期后，9月2日，全国正式庆贺玛丽的归国。女王骑着马出现在游行队伍里，沿着坡度很大的街道从要塞走向老城区。居民们围在路旁，向她欢呼，惊讶于她的美貌，他们从现在起要效忠于她。当这位年轻漂亮、具有自我意识的苏格兰女王高高地骑在马上，目光扫过她的民众时，心里在想什么呢?她想起了在法国度过的无忧无虑的时光吗?在卢瓦尔河谷和巴黎长大的玛丽，第一眼看见自己既熟悉又陌生的故乡时，必定会感到失望。除开西海岸令人印象深刻的高原外，整片国土全是单调的草地，平坦而毫无起伏变化，森林很少。宽广的平原上，几乎总是刮着强风，与法国的全然不同，那儿的风清冷而湿润。村庄和房屋毫无装饰，一股穷相。全国只有很少几座城市，城市内也只有很少几座房屋，它们战战兢兢地围筑在要塞碉堡边。街道状况恶劣，几乎不能行车。幸好马车只是自156l这一年起，才开始投人使用，而且只是为了玛丽的宫廷社交活动。苏格兰根本没有像爱丁堡的圣十字架宫，苏格兰女王的
私人居室位于它的二楼。卢瓦尔河边那样的豪华宫殿，城堡都是些冷冰冰的、毫无人味的军事要塞。而且苏格兰社会深受苏格兰高地部落的影响，他们自主地统治着自己的小国，如果国王遵守自己的限度，不去插手他们的事务，他们才与国王统一行动。顺从和忠诚不是他们的长处。因此，他们自古以来是国王和民众之间的障碍。这些部落的首领没一个是彬彬有礼的绅土，全是些没有教养、被狂风和威士忌塑造出来的粗鲁汉子。他们中许多人没有受过教育，是文盲，而且他们相互敌视，每个人不断地变换盟友，可与其他任何人作战。“钱财和好处”，法国使者忿怒地写道，“是苏格兰贵族们惟一着迷的东西。向他们宣讲对自己的国君、荣誉、正义、美德和高贵的行为所负有的义务，只会引起他们发笑。”
最近几十年来，他们之间为了真正的宗教信仰，争吵次数越来越多。人们常常并不清楚，他们是真正对此感兴趣呢，还是出于政治策略。无论如何，贵族们分裂为不同阵营。玛丽·斯图亚特不可避免地纠缠其中，因为她表了态，坚持自己的信仰。然而，她努力在新教教徒和天主教徒之间保持一种平衡关系，部分原因出于天主教的信念，部分原因是为了求得安静。她最大的敌人并非来自贵族团体，而是来自神职人员：她的主要敌人是约翰·诺克斯。
在玛丽刚回国时，约翰·诺克斯就已在圣吉尔吉斯教堂发表的一篇偏执的演说中咒骂过她：“一个女人坐在王座上，已经够让人恶心的了，尤其她还是一个天主教徒。一个法国女人是女王，只是一个被当作偶像的人，一个女人的使命不是统治男人。”约翰·诺克斯拥有大批听众，他们醉心于约翰的演讲。在玛丽回家的第一个星期天，他们就试图冲击她做礼拜的小教堂。9月4日，她接见了这位牧师：被同代人描述为刚愎自用、冷酷无情的宗教狂热分子的诺克斯这样仇视天主教，以至于他这个最好的教条主义者早已忘记，是什么使他作为一个新教徒反对天主教会的教条。他进行了一场“战斗”，他后来叙述与女王的会面时说。为了努力使两人沟通，女王让诺克斯讲述自己的观点，听他说臣民有权起义反对违抗上帝指令的统治者。当玛丽提出异议时，诺克斯当即指责她：“我担心您缺乏正确的知识。”玛丽当时还维持着风度和镇静，后来却在自己的私人住所里痛哭失声。
爱丁堡的圣吉尔吉斯大教堂，约翰·诺克斯在
此布道，他是玛丽最主要的宗教敌人。
女王重视为两种宗教进行调停。她不愿强迫民众接受她的宗教信仰，同时，天主教徒也不应再继续受到迫害。玛丽的宗教政策很快犯下毁灭性的策略错误。起因是年轻的约翰·戈登·亨特利伯爵，动手殴打了玛丽的总管家。作为惩罚，女王把这位年轻人革出社会，不再受法律保护，他事后一直藏匿在父亲那儿。玛丽命令他父亲把儿子交出来，但老伯爵拒绝听从女王的命令。这位身为天主教徒的女王，率领她的新教徒组成的军队，与强大的信奉天主教的亨特利家族开战!老伯爵被心肌梗塞夺去生命，小伯爵最终被逮捕和处死。家族财产被查抄。玛丽把亨特利家族的巨额家私送给自己的继兄弟詹姆斯，现在的莫里勋爵。天主教徒们完全惊呆了。
苏格兰的风景，玛丽·斯图亚特的故乡。
紧跟着玛丽·斯图亚特集中精力处理与英国的关系。她派遣自己的顾问威廉·梅特兰前往伦敦，邀请伊丽莎白一世与她会谈。玛丽定下目标，要理清与英格兰表姐的混乱关系。而双方结下矛盾的原因不只在于英格兰与苏格兰的立场相左。伊丽莎白一世自1558年登上王位——非法地，许多人声称，包括玛丽的家庭：作为亨利八世与安娜·博林的第二次婚姻带来的孩子，伊丽莎白在天主教徒的眼里是一个私生子，因为亨利八世与第一位妻子的离婚没有得到教皇的同意。尽管亨利本人也把伊丽莎白排除在王位继承人之外，可她在姐姐玛丽和哥哥爱德华死后，五年前，即1558年成为英格兰女王，即使英国的天主教派人土和许多欧洲君主都认为这是违反法律的。这些人的要求如下：玛丽·斯图亚特有继承英王大统的合法权利，因为亨利八世的父亲是玛丽的曾祖父，由此她于1558年成为惟一合法的女继承人。另一方面，亨利八世在遗嘱中规定，英国王冠绝对不允许落人一位外国人手里，这也将玛丽摒弃在继承人外。然而，在同一年，她那热爱权势的公公法王亨利二世敦促她把英国国徽图案纳入她自己的徽记中，使她明显表现出她对英国王位的权利和要求。这一举动为一场无休止的争吵埋下了种子。
玛丽在返回苏格兰后，随即好心地建议伊丽莎白：她自己根本不想要英国王冠，但她会为自己的孩子保留这一要求，而这时她还没有孩子。伊丽莎白被激怒了。两位女王成为势不两立的对手，原因早巳超越政治和宗教差别，而带有私人恩怨的色彩。
玛丽和伊丽莎白是两种完全不同性格的人：这位苏格兰女人热情洋溢，脾气暴躁，由于自幼便在众星捧月的氛围中长大，她惯于过高评价自我。而这位英格兰女人正好相反。因为直到登上王位前一直被骂为杂种，她养成了内向、谨慎、自我控制的习惯。她受到自己民众的爱戴——她的臣民们从未像庆祝伊丽莎白的登基时那样兴高采烈地欢迎过其他统治者，然而，她看起来神经质、难以接近、倨傲。她嫉妒地注视着北方，在那儿，人们为苏格兰女王的魅力所倾倒。玛丽驻伦敦的使节詹姆斯·梅尔维尔不得不用外交技巧回答伊丽莎白关于玛丽的问题。“我告诉她”，他回忆道，“英国没人能与她相提并论，也并能与苏格兰女王相提并论。因为她并不满意这一回答，我不得不对她说，她比苏格兰女王的脸色更白皙。”连玛丽比她高也造成了伊丽莎白的困扰。“那么她太高了”，她反驳梅尔维尔，“因为我这么高恰恰好”。
爱丁堡的圣十字架宫，苏格兰女王的住所，
今天大不列颠王室家族的正式宫邸
玛丽·斯图亚特明白自己对于男人的魅力。她很喜欢在公共场合出现，喜爱运动，大胆地在田野和草原上骑马驰骋，还经常无拘无束地与随从出没在爱丁堡的大街小巷。她热爱音乐和舞蹈，习惯于法国宫廷的优雅和舒适，尝试在苏格兰宫廷建立起某种类似的社交圈子。这一切极大地惹恼了诺克斯，他从这一切中察觉到了魔鬼的奸计。年轻女王的淘气和欢快却常常转变为忧郁和绝望，在这种时候，她被政治问题弄得落落寡合，难以接近。
执政的最初几年，她不能从处理行政事务方面找到任何乐趣。因此，她宁愿把这些事情交给她的继兄詹姆斯，他是最富有的领主和她的智囊之一，但他通常更关心的是自己的利益，而非国家的。当玛丽参加议会会议时，经常只是坐在那儿刺绣。
玛丽需要一个男人
玛丽·斯图亚特已经做了五年寡妇了。她太年轻了，不应该单独一人过日子，而且国家也需要一位王位继承人。但是决定谁作王夫非常困难。挑选一位苏格兰贵族做王夫意味着冷落和侮辱了其他所有家族。参议会看好的西班牙国王的次子堂·卡洛斯发了疯。奥地利皇太子卡尔大公太穷，阿兰的年轻伯爵为他的爱人发了疯，引起人们议论，后来被逮捕。宫廷诗人皮埃尔·德·夏特拉藏在玛丽床下，企图强暴她，然而他被发现了，为自己的追求付出了生命的代价。或者，正如谣言所说，他本身与女王有不正当关系，只是显然因为惹恼了她，所以她故意让他被众人发现，以便摆脱他。英格兰的伊丽莎白同样卷入了这件事。她特别推荐了罗伯特·杜德利，后来的莱斯特伯爵。同时她宣称，如果玛丽选中一位英国贵族，她将善意地考虑玛丽对英国王冠的要求，用以引诱玛丽。然而，正如每个人都知道的，莱斯特是伊丽莎白的宠臣，玛丽当然不愿意要他。
苏格兰女王最终自己作出了抉择。令所有人惊愕的是，她迷上了一个小她三岁的男人，他是她的近亲。众所周知，他风度迷人，教养良好，是个光彩照人的舞蹈高手。但他是个花花公子，怯懦软弱：他就是亨利·罗德·达恩利。玛丽的决定几乎让人无法理解。她需要的是这种男人：他能保护她不为阴谋和敌视所伤害，能为她撑腰作主。但她选择的男人却是胆小如鼠、见风使舵的那一种。选择亨利·达恩利也许是玛丽所犯的最大错误。
1565年7月29日清早，婚礼在圣十字架宫的天主教小教堂举行。既是寡妇又是新娘的玛丽再度披上白衣。此外，玛丽独自出现在教会的欢庆典礼上。与女王同为天主教徒的亨利，由于害怕新教贵族们对此婚事的反对，没有出席婚礼。这次婚姻一开始就兆头不好。可爱情似乎使玛丽瞎了眼。“没有人能够取悦于她，如果这个人之前没有得到他(亨利)的赏识，更糟糕的是，她完全按照他的意愿行事，让自己受他领导，正如他喜欢的那样”，英国使节这样向伦敦报告。