随“贝格尔”号军舰航行的几年里，改变了达尔文的人生，也改变了生物学。达尔文在《物种起源》的开头如此写道：“当我作为一名博物学家随‘贝格尔’号航行的时候，有关南美洲栖息生物的分布以及那块大陆上现存和过去的栖息生物的地质关系的某些事实，给我留下了深刻的印象。在我看来，这些事实多少能够用于阐明物种的起源——这个我们最伟大的哲学家之一所说的神秘中的神秘。”
究意是什么让达尔文敢于怀疑物种不变观念，创立生物进化论呢？达尔文晚年在自传中说，有三件事实给他留下了深刻印象：一是在南美大草原发现大型动物化石有犰狳一样的盔甲；二是从美洲大陆南行，邻近动物物种相互取代的方式；三是加拉帕戈斯群岛上的生物群多数有着南美生物的特征，特别是每个岛上的生物群相互之间略有差异的情形。“很明显，只有假定物种是逐渐改变的，才能解释类似这样的事实，以及其他许多事实。”
“贝格尔”号在南美海域航行了三年多，其间达尔文多次上岸做地质考察。他在岸边挖到了一些树獭、犰狳和美洲鸵的化石。这几种动物在当地都还生存着，但是比化石小多了。显然这些化石代表的是已灭绝的物种。达尔文仔细地探测了发现化石的地层和周围环境，判断这些化石的年代并不久远，而且没有发生过大洪水的任何迹象，也没有发生过其他灾难的迹象。这些生物的灭绝不像是灾变引起的，那么这些生物为什么会灭绝？它们与现代树獭、犰狳和美洲鸵是否有亲缘关系，都是从同一祖先分支演变来的？
达尔文对他所观察到的生物地理分布现象感到更加疑惑。自然神学认为上帝为每一个地区设计了适应那里的生存环境的物种。但是这个简单的解释难以说明复杂的生物地理分布现象。达尔文注意到，在南美海岸，动物群和植物群的变化极为明显。比如从阿根廷的布宜诺斯艾利斯到圣菲，纬度仅仅变了3°，物种却变了很多。达尔文在很短时间内，就观察到有六种鸟是从前在布宜诺斯艾利斯没见过的，这两个地方这么靠近，地理环境又那么相似，上帝造物时会让给每一个地方各造出那么多不同的物种？美洲鸵鸟特别让达尔文感兴趣，这种无翅鸟和非洲鸵鸟一样，都适于在开阔的草原上过类似的生活，然而它们的形态又非常不同。上帝为什么不为有着相同的生活条件的所有地区制造同一物种，却要让南美和非洲有不同的生物群呢？在南美巴塔哥尼亚大草原旅行时，达尔文起初只注意到普通美洲鸵。往南旅行了一段距离之后，达尔文的伙伴抓了一头美洲鸵来吃，达尔文才注意到那是一个新物种，与前面见到的普通美洲鸵不同。为什么在北边草原上生活的是普通美洲鸵，到南边草原却变成了新种美洲鸵？二者的地盘并无明确的界限，在中间地带同时生活着两个物种。如果是因为南北方环境的差异，上帝为南北方各创造了一种美洲鸵的话，又如何解释它们在中间地带相互竞争的事实呢？
达尔文对加拉帕戈斯群岛上的生物群有很深的印象。加拉帕戈斯群岛在厄瓜多尔以西约1000公里处，由16个或大或小的火山岛组成，岛与岛之间的距离往往只有几公里。我们现在知道，这个群岛形成于大约400万年前，从来未跟南美大陆连在一起。1835年9～10月，达尔文在岛上观察了五个星期。那里的动植物虽然总体上跟南美大陆的相似，但又有着明显的、与大陆动植物不同的特征，例如，那里没有吃虫的莺和啄木鸟，却有多种鸣雀有吃虫的习性，而这类雀在其他地方是以吃种子为生的。而且，这个群岛的一些岛上，也有自己的特有种，其形态与其他岛上的特有种既相似又不同。达尔文写道：“有几个岛拥有属于自己的龟、效舌鸫、鸣雀和众多植物的物种，这些物种有相同的一般习性，占据类似的地势，并明显是填补了这个群岛的自然体系中的相同位置，正是这种情形使我感到惊奇。”这些物种中最引人注目的是那些巨龟（“加拉帕戈斯”的在西班牙语的意思就是龟）。它们成群结队地在岛上的沙滩上漫游，总共有14种或亚种，而且岛与岛之间的巨龟的形态——特加拉帕戈斯群岛上的巨龟别是龟壳——差别非常大，以至于岛上的副总督向达尔文吹牛说，他只要瞄一眼，就知道哪只龟是哪个岛上的。为什么上帝要在这小小的角落显耀他的创造才能，他真有必要专门为这里创造出这许许多多独一无二的物种吗？达尔文忙于做地质考察和采集标本，没有时间仔细思考上述问题。
离开加拉帕格斯群岛后，他开始细细回味在岛上的所见所闻。1836年7月，他在日记中记载下：“这个群岛的动物学值得仔细研究，因为它可能会推翻物种恒定的观念。”群岛上的效舌鸫对达尔文进化思想和形成起了重要作用。他在群岛上采集到三种效舌鸫标本，看上去与美洲大陆的效舌鸫很相似，当时他以为是由大陆的效舌鸫演变来的三个变种。1837年3月他回到英国后，把标本交给著名鸟类学家约翰·古尔德鉴定，古尔德告诉他那不是三个变种，而是三种不同的物种。他恍然大悟，明白了地理隔离能够产生新物种：美洲大陆的效舌鸫在偶然（例如，被风吹裹）到达加拉帕格斯群岛之后，其后代以不同的方式适应新的环境，不是演变成了三个变种，而是变成了三个新的物种，物种是可变的！这显然要比认为上帝无缘无故地分别给不同的岛屿创造了不同的物种要合理得多。他进而开始创建共同祖先学说：如果群岛上的三个效舌鸫物种都源自一个共同祖先——美洲大陆的效舌鸫，那么也可以联想到，所有美洲大陆的效舌鸫物种也都源自一个共同祖先，以此类推，所有的属、科、目、纲……所有的生物，都源自共同祖先。