1859年法国博物学家、巴黎科学院通讯院士普歇发表“异源发生论或自然发生论”的论文与法国微生物学家巴斯德间又展开类似的争论。普歇认为在具备有机物、水、空气和适当温度的条件下自然发生能被促进，并设计实验企图证明他的观点。巴斯德根据他从事发酵工作的经验，认为“酵素”实际是生命有机体，并确信空气中的微生物也来自酵素。1860～1861年L.巴斯德用火棉及S形长颈瓶进行实验，证明空气中的尘埃携带着各种微生物；而且随着场所和高度的不同，空气中微生物的含量也不一样。他在高山上做实验，由于高山上空气新鲜，微生物及孢子少，所以酵母浸液受污染的机会也少。1863年普歇在西班牙做了类似的试验，得到与巴斯德相反的结果。于是引起了论战。1864年法国科学院安排论战双方做实验，巴斯德做完上述实验后，普歇就宣布退出争论，未做实验。1876年英国巴斯特兰作为自然发生说的支持者，就微生物能否在中性或碱性尿液内自然发生与巴斯德展开争论。巴斯德重复了他的实验，认为它只证明某些低等芽孢在中性或微碱性培养基内能抗100℃高温。1877年巴斯德又提出巴斯特兰的容器可能已受污染。以后通过科赫、廷德尔等的工作，表明确实存在着一种高度抗热的细菌内生孢子，某些微生物也能在100℃酸性培养基内存活。而且尽管对实验容器预先消毒，在某些溶液内仍有微生物出现。巴斯德这才充分认识到在普歇及巴斯特兰等自然发生说的支持者所用的溶液内，有时可能一开始就有这样的微生物存在，而非由于实验技术操作不慎所致。以后巴斯德提出外科医生在更多注意消灭器具或手上的微生物，而不是空气中的。1879年钱伯兰证明，消灭液体内的抗热微生物至少要115℃，而消灭干燥表面的则要180℃。1897年E.毕希纳证实无细胞酵母提取液可使糖发酵产生酒精，驳斥了巴斯德关于酵素是生命有机体的观点。但这并不影响巴斯德在否定自然发生说中的重要地位。
五、微生物学的开端
19世纪30年代，法国生理学家拉图尔于1836年和施旺于1837年分别报道了酒精发酵与酵母有关。1857年L.巴斯德在关于乳酸发酵的报告中指出，除了啤酒酵母之外，在糖变成乳酸的过程中，还有乳酸酵母在起作用。他对发酵所必需的化学物质和发酵产物的化学成分也作了较详细的分析。1865～1870年，巴斯德发现蚕病有两种，即蚕微粒子病和软化病，并通过选用健康蚕蛾的卵以及防止病原感染等措施保证了蚕丝生产。德国细菌学家科赫于1876年已揭示炭疽病杆状弧菌的生活史，确定它有一内生孢子期，指出了传病途径，并首先证明这是由细菌感染引起的疾病。1878年，巴斯德检验因炭疽病致死动物不同时间的血液，发现随着时间的延长，血液内的杆菌逐渐为败血弧菌所代替，从而说明了死后二三天的病畜血液内没有杆菌的原因。由此澄清了关于炭疽病争论中的一些问题。1878～1879年，巴斯德发现经连续培养可减低鸡霍乱病菌毒性，使鸡得病而不死亡，由此试制鸡霍乱疫苗获得成功。1880年，他转向研究炭疽病疫苗，以后又研究猪丹毒疫苗，均获成功。1881～1884年，巴斯德研究狂犬病疫苗，并于1885年7月救活一名9岁的男孩。
英国外科医生利斯特受到巴斯德工作的启发，联系到外科手术中的感染问题。于1867年发现用石炭酸作消毒剂可大量减少手术后的败血症，使病人死亡率明显降低。
1882年3月科赫在柏林生理学会作题为《论结核病》的报告，指出结核杆菌是当时发生普遍、危害严重的肺结核病的根源。1883年，科赫受命去埃及研究霍乱，后又去印度继续研究，分离并鉴定了霍乱病菌。1884年，他成功地找到霍乱交叉感染的途径及隐患，找到有效控制霍乱的方法。
科赫还不断改进对细菌的染色法和培养法，这对以后发现各种病原菌起了很大作用。
19世纪后期，在巴斯德、科赫等工作的基础上，对免疫机制的研究形成了两个学派。俄国动物学家、免疫学家梅契尼科夫在研究炎症时发现微生物在血细胞内被消耗的现象，认为血细胞具有保护有机体防止感染性物质侵袭的作用，提出细胞吞噬理论。科赫则主张体液论，认为免疫依赖于血液和体液中诱导出来的某些因子，为以后免疫学说的发展提出了重要的依据。1892年，俄国微生物学家伊万诺夫斯基发现烟叶可被能通过滤器过滤的花叶病汁所感染。1897年，德国细菌学家勒夫勒证明引起牲畜口蹄疫的也是一种可通过滤器过滤的病毒。这是揭开非细胞微生物---病毒奥秘的开端。
六、细胞学说的建立
19世纪20～30年代，有些学者提出“小球”可能是植物或动植物的基本结构。其中法国生理学家迪特罗谢曾明确指出所有动植物的组织和器官都由小球构成。但是他所指的小球比较含糊，有时是细胞，有时是细胞核，也有时甚至是早期显微镜缺陷所造成的衍射圈。与此同时，有些学者开始采用消色差显微镜。1831年，英国植物学家布朗在兰科植物叶片表皮细胞中发现了细胞核。1835～1837年，捷克生物学家浦肯野及其学生瓦伦廷对构成动物某些组织的“小球”进行描述，并提到与植物细胞有相似性。
1838年德国植物学家施莱登发表《植物发生论》，提出只有最低等的植物，如某些藻类和真菌是由一个单细胞组成的。高等植物则是各具特色的、独立的单体即细胞的集合体；因而认为细胞是组成植物的基本生命单位。
德国动物学家施旺于1837年10月，获悉施莱登的研究成果而受到启发，认识到从细胞核入手对论证植物细胞与动物细胞的一致性有重要意义。他于1839年出版《动植物的结构和生长一致性的显微研究》，提出了细胞学说。他把动物的永久性组织分为5类，分别研究了血细胞，指甲、腱、骨、齿、肌肉、神经等，证明它们都是有核的细胞或是细胞分化的产物。他接受施莱登的观点，并发展为细胞可由细胞内或细胞间的一种无结构物质即细胞形成质产生。他根据研究结果提出一切动物和植物都是由细胞组成的，有机体的各种基本组成都有一个共同的发育原则，即细胞形成的原则，并认为细胞是生命的基本单位。
七、进化论的确立
英国医生、哲学家E.达尔文是C.R.达尔文的祖父。曾受布丰进化思想的影响。他认为人工饲养、气候、杂交等原因可使动物发生变异，而且这种变异是可以遗传的。法国生物学家拉马克认为对各个动、植物的研究虽是必要的，但为了探讨作为一个整体的生命世界的共同法则，一定要对动物和植物进行统一的研究。他早期研究植物时，相信林奈的物种不变说。18世纪90年代后期，通过软体动物化石及与近代种类的比较研究，发现彼此间的相似性，才使他相信存在着许多种系列，在整个历史时期内，经历着缓慢的渐变。他于1800年开始持有这种进化观点，并在1809年出版的《动物哲学》一书中对有关进化的问题进行了全面系统的讨论。
19世纪前期，自然神学在英国学术界有很大影响，英国比较解剖学家欧文就持这类观点。他是居维叶的学生，也是拉马克进化论的反对者，在英国学术界很有影响。英国地质学家莱尔反对灾变论，是“均变说”的积极拥护者。
但他在《地质学原理》第二卷讨论到动物变异等问题时，对拉马克学说进行了尖锐批评，他的著作对C.R.达尔文及其进化论的传播虽有重要影响，但他本人在较长时间内也是反对进化论观点的。
1844年英国博物学家R.钱伯斯以化名出版了《自然创造史的痕迹》，书中大胆表明进化观点，曾轰动一时，成为畅销书。总之，在C.R.达尔文的《物种起源》出版之前，在英国接受进化思想的人极少。
C.R.达尔文于1831年，参加“贝格尔”号舰的环球航行，在5年航海生活中他观察到大量的现象，收集到丰富的材料。1837年3月，当他从鸟类学家古尔德处获悉，在加拉帕戈斯群岛的3个岛屿上采集到的地雀，确有种的差异时，使他终于认识到地理因素引起物种形成的过程，从而彻底否定了物种不变的观念。1837年7月他开始就物种变异问题进行写作，根据他的亲自观察和阅读过的大量书刊，使他相信自然界的一切变化都是逐渐的而不是突然发生的。
1838年10月当他阅读马尔萨斯的《人口论》时，使他体会到在动、植物界到处进行着生存斗争，在这样的环境条件下有利的变异将被保存，不利的变异将被消灭。其结果就是新种的形成。因而得出了自然选择的理论。1842年6月达尔文用铅笔写出了这种观点的摘要，共35页；1844年夏季，又把它扩充到300页。但这仅是一个手稿，且只有很少人知道。
1855年英国博物学家华莱士发表了一篇题为“制约新种出现的规律”的短文，它并未引起重视。直到1858年华莱士寄去请求发表的论文——“论变种无限地离开其原始模式的倾向”，才使达尔文感到震惊，促使他加快了《物种起源》的写作。
华莱士曾先后去过亚马孙河及马来群岛考察，并受莱尔和达尔文著作的启发，研究物种起源并独立地得出了生物通过自然选择而形成新种的概念。与达尔文不同的是他更多依据动物地理分布的材料，指出一个物种种群的大小，毫不取决于生殖力，而取决于对潜在的种群增长的自然控制。华莱士强调个体的变异，即种群内的各个个体并不具有完全相同的特性。一个物种如产生出一优良的变种，它在数量上也必占优势。在莱尔和胡克的建议下，达尔文和华莱士的联合论文于1858年7月1日在伦敦林奈学会上宣读，并于8月20日发表于林奈学会会刊上。
从1858年起到1859年3月，达尔文完成了《物种起源》一书的写作。鉴于英国当时接受进化思想的人很少，他预见到该书的出版一定会引起激烈的争论，因此，他把样书分送给莱尔、胡克、赫胥黎及格雷以争取他们的支持。1859年11月24日《物种起源》出版，当天即被抢购一空。同时，《物种起源》也遭到了学术界、宗教界等方面的强烈反对，甚至恶毒诽谤。但是《物种起源》也受到英国和其他国家一些学者的积极支持，像英国的赫胥黎、德国的海克尔等，都为达尔文进化论的传播作出了重要贡献。
八、遗传规律的发现
奥地利布隆修道院修道士孟德尔对植物杂交和遗传现象很感兴趣，仔细阅读过前人的工作，包括格特纳的著作。他于1856年开始从事豌豆杂交试验，由于受翁格尔关于研究变种是解决物种起源的关键这一思想的影响，他采用了种群分析法，而不是研究单个个体。他选择了豌豆品种这一理想材料作为研究对象，又把工作限于彼此间差异十分明显的单个性状的遗传过程，而使实验结果大大便于统计分析。经过8年研究，孟德尔于1865年2月8日和3月8日两次在布隆自然科学协会上报告了他的实验研究结果。反映实验结果的论文《植物杂交的试验》发表在1866年《布隆自然科学协会会刊》第4卷上。他的主要结果可概括为：①分离规律。杂交第一代通过自花授粉所产生的杂种第二代中，表现显性性状与表现隐性性状个体的比例约为3∶1；②自由组合规律。形成有两对以上相对性状的杂种时，各相对性状之间发生自由组合。孟德尔为解释这些结果，提出一些假设。如遗传性状由遗传因子所决定；每一植株含有许多成对的遗传因子；每对遗传因子中，一个来自父本雄性生殖细胞，一个来自母体雌性生殖细胞；当形成生殖细胞时，每对遗传因子互相分开，分别进入一个生殖细胞等等。刊载孟德尔这一突破性的重大研究成果的布隆自然科学协会会刊曾被分送到120个单位，在欧洲很多图书馆内都可找到这篇论文。孟德尔本人还把论文寄给当时植物学界的权威人士内格利。但他的成就对他同时代的生物学家和有关遗传的研究没有产生影响，被埋没了35年之后，直到1900年才被重新发现。
与孟德尔同时代的C.R.达尔文在1868年出版的《动物和植物在家养下的变异》一书中，提出“泛生论”的暂定假说，说明他并未看到孟德尔的论文。达尔文设想体内的各类细胞中，均具有代表其自身的胚芽。杂种内的镶嵌特征是亲本胚芽混合所致。但是达尔文的这一假说很快就被其表弟高尔顿的输血实验所推翻。
1884年内格利根据受精卵内卵子原生质多于精子原生质但并不体现出更多遗传性状的事实，推测有两种原生质。
一种称种质。它在卵细胞和精子细胞内是等量的，控制个体发育和系统发育，是遗传性状的携带者和变异的决定者；另一种为营养质大量贮存在卵内，主要起营养作用。内格利的上述观点，对施特拉斯布格、赫特维希、克利克、魏斯曼等后来提出核物质是遗传性状的载体，影响很大。
在自然哲学原型思想的影响下，随着显微镜的改进，19世纪30年代末，施莱登与施旺建立了细胞学说，提出细胞是构成动、植物的基本结构与功能单位，并具有共同的形成规律，大大促进了细胞学和胚胎学的发展。1859年，达尔文进化论的建立，对生物学及其他有关学科的发展产生了重大影响。19世纪中后叶，物理、化学和一些数学的知识和研究方法，逐渐渗入生物学的研究领域，使生物学、特别是生理学向着较深的层次发展。
总之，19世纪生物学的巨大成就，是20世纪生物学的深入发展的先导。