二十世纪，很多科学家运用物理学和化学对光合作用进行深入探讨。
1905年英国植物学家布莱克曼提出光合作用包括需要光照的“光反应”和不需光照的“暗反应”两个过程，二者相互依赖，光反应时吸收的能量，供给暗反应时合成含高能量的多糖等的需要。20年代，瓦尔堡进一步提出在光反应中不是温度而是光的强度起作用。1929～1931年荷兰微生物学家范尼尔通过比较生化研究，发现光合硫细菌与绿色植物一样，也进行光合作用。德国化学家维尔施泰特经过了8年的努力，于1913年阐明了叶绿素的化学组成。虽然光合作用的部位早就被认为是叶绿体，但真正用实验加以证实则在20世纪30年代末40年代初。英国植物生理学家希尔用离体叶绿体做实验，测到放氧反应，这是绿色植物进行光合作用的标志。1954～1955年，美国生物化学家阿尔农美国微生物学家艾伦又证明离体叶绿体不仅能放氧，而且也能同化二氧化碳。这也就证实了叶绿体确是光合作用的部位。
美国伯克利加州大学的卡尔文、本森、巴沙姆等，利用劳伦斯实验室制备的同位素的和其他新的生化技术，花了10年的时间于50年代中期阐明了“光合碳循环”，或称“卡尔文循环”的过程。他们证明，在叶绿体内一种五碳糖起了二氧化碳接收器的作用经过一系列的酶促反应，不断地循环同化二氧化碳，形成一个一个的六碳糖，再聚合成蔗糖或淀粉。
光合磷酸化是光合作用中的重要的能量传递过程。
1954年阿尔农在用菠菜叶绿体研究二氧化碳同化的同时，发现叶绿素受光的激发产生电子，在传递过程中与磷酸化偶联，产生ATP，电子仍回到叶绿素分子上，继续上述过程，这一过程被称为循环光合磷酸化。1957年阿尔农等又发现另一类型的光合磷酸化。在这个过程中，光使叶绿素从水中得到电子，电子传递过程中与希尔反应偶联，还原辅酶，放氧，同时产生ATP，这一过程称为非循环光合磷酸化。
进入20世纪80年代，光合反应中心的结构研究取得了重要突破，1982年联邦德国生化学家H.米舍尔成功地分离提取出生物膜上的色素复合体，即光合反应中心。以后德国的蛋白质晶体结构分析专家休伯和戴维森，经过4年的努力，用X射线衍射分析的方法，测定出这个复合体的复杂的蛋白质结构。这一成果在光合作用研究上是一个飞跃，有力地促进了太阳光能转变为植物能的瞬间变化原理的研究。