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第22章 一探究竟——常见的组织细胞培养方法

体内组织细胞在体外培养时,所需的培养环境基本类似,但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同,各自的要求条件有一定的差别,所采取的培养技术措施亦不尽相同,下面简单介绍一下个别组织细胞培养的要点。

1.上皮细胞培养

上皮细胞包括腺上皮,是很多器官(如肝、胰、乳腺等)的功能成分,又由于癌细胞起源于上皮组织,故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中经常混杂有成纤维细胞,培养时生长速度比上皮细胞还要快,并难以纯化,同时上皮细胞难以在体外长期生存,因此,纯化和延长生存时间是培养的关键。

体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜中,因此,培养在有胶原的底物上可能利于生长。另外,人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层(用射线照射后)时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH值、钙离子含量和温度、向培养基中加入表皮生长因子,均有利于表皮细胞的生长。

以表皮细胞为例,用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞,方法如下:

(1)取材:外科植皮手术残余的皮肤小块或早产、流产儿的皮肤,取比较薄的角化层,切成0.5~1平方厘米的小块。

(2)置0.02%的EDTA中,室温环境下5分钟。

(3)换入0.25%胰蛋白酶中,温度保持在4℃。

(4)分离:取出皮块,用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。

(5)取出表皮,剪成更小的块后,置于0.25%的胰酶中,37℃的环境下,30~60分钟。

(6)反复吹打,制成悬液。

(7)培养:用80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸去上清。

(8)直接加入培养基制成细胞悬液,接种入培养瓶,CO2温箱培养。

2.内皮细胞培养

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞,对于研究内皮细胞再生、肿瘤、促血管生长因子等有很大价值。

人的脐带是胎儿和母亲相连的部分。通过脐带,胎儿获得生活所必须的营养物质和氧气。脐带在医学上非常有用。有些父母热衷于把新生儿的脐带血保存起来,可以治疗很多的疾病,比如白血病,恶性肿瘤等等。研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便,方法如下:

(1)产后新鲜脐带,无菌剪取10~15厘米长的一段,如不能立即培养,可于12小时内保存于4℃的环境下。

(2)用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血,在入口处用线绳扎紧,以防液体返流。

(3)用血管钳夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中缓慢地注入浓度为0.1%的粗制胶原酶,充满血管,消化3~10分钟;注入口用线绳扎,以防液体返流。

(4)吸出含有内皮细胞的消化液,放在离心管中,注入温PBS轻轻反复冲洗后,一并注入离心管中(此步骤可重复)。

(5)离心去上清,加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置温箱培养。两至三天就能发现细胞长成单层。

3.神经细胞培养

神经是人体的指挥中枢,是最复杂也是最神秘的器官之一。神经细胞(神经元)不易培养,只有在适宜情况下,如接种在胶原底层上,或加入神经生长因子和胶质细胞因子时,可出现一定程度的分化,长出突起等现象,但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养,不仅能获得生长的胶质细胞,也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来,胶质细胞在培养中生长不稳定,不易自发转化,但对外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。