继“西湖会议”后，中国共产党于1923年6月在广州召开了第三次代表大会。这时陈独秀的观点发生较大变化，他赞成国共合作，也赞成了全体共产党员以个人身份加入国民党，但他夸大了资产阶级和国民党的力量，忽视工人阶级和共产党的作用，提出“一切工作归国民党”的口号。大会对陈独秀的右倾观点有所警觉，但批评不够。所以，在党的“三大”上，长。
国共合作实现后，以广州为中心，汇集全国力量，很快开创了一个反对帝国主义和封建军阀的革命新局面，在革命形势飞跃发展的同时，一股反动的逆流也迅速滋长。一向坚持国共合作的孙中山逝世后，国民党内部新老右派变本加厉地进行同共产党的分裂活动。可是，陈独秀在这种进攻面前，总感到自己力量不足，唯恐同国民党新右派的斗争会导致国共关系的破坏，使广东革命局面陷于孤立以至失败，因而一味主张单方面的退让，企图用这种方法使国民革命阵营内的矛盾得到缓和。例如，在国民党“二大”召开时，广东共产党组织的领导者主张打击右派、孤立中派、扩大左派的政策，并计划给蒋介石以回击。但是，在陈独秀的影响下，对国民党新右派却没有行动。中共主要领导人的一再退让，丝毫没有使革命阵营内部的矛盾缓和，反而更壮了国民党新右派的胆。在国民党“二大”后才两个月，蒋介石就制造了“中山舰事件”。一个多月后，在国民党二届二中全会上，蒋介石又提出一个《整理党务决议案》，陈独秀继续坚持退让政策，并派张国焘等人以中央代表身份在会上贯彻其让步政策，完全接受这一反对提案，共产党在国民党党务方面变得毫无地位。在陈独秀的这一系列妥协政策的退让下，蒋介石最终还是脱下革命的伪装，公开叛变革命。1927年，他亲自制造了“四一二”惨案，据不完全统计，在事变三天中，遭杀害者300多人，流亡失踪者5000多人。
在这革命和反革命进行激烈搏斗的时刻，为了总结过去，确定党在紧急时的方针，中共“五大”于1927年4月27日至5月9日在汉口召开。陈独秀作了长达5个小时的政治报告，为其错误路线进行辩护，还提出了向“西北”以联合冯玉祥的国民军的错误主张。由于处于幼年时期的中国共产党还不成熟，会上仍选举了陈独秀为总书记。这样，由于陈独秀当权在党面临生死存亡的危急时刻，徒然丧失时机，坐视整个局势继续恶化。
5月21日，长沙反动军官许克祥发动“马日事变”，捣毁湖南省总工会等革命团体，激起群众极大愤怒。陈独秀害怕农民武装进攻长沙会“引起整个政局的纠纷”，强令“农民不得进城武装斗争，湖南问题静候国民政府解决”。结果，20多天内，就有共产党人和工农群众一万多人遭杀害。与军队叛变的同时，汪精卫集团利用已被他们控制的党政机关，发出一系列限制工农运动的禁令。正值革命紧要关头，共产国际和斯大林，在5月份对中国共产党二次发出指示，要求组织军队，保卫革命。但陈独秀却扣下“指示”不予执行，并下令在国民党党部和报馆工作的共产党员，听从国民党的命令和指导，不得有任何独立的主张，要求写文章批判农民的“幼稚”，纠正农民“过火”的行动。6月28日，陈独秀下令解散工人纠察队，将全部枪枝弹药交给国民党，以表示和国民党合作的诚意。30日，他操纵党中央扩大会，通过了他起草的“国共合作二十一条”，承认国民党是“当然处于国民革命之领导地位”，可以用“请病假”的名义退出政府，工农群众团体“均应受国民党之领导与监督”，工农武装“均应服从政府之管理与训练”，等等。陈独秀的右倾投降主义已发展到登峰造极的地步，第一次国内革命不可避免地遭到失败。后来，据党的六大所作的不完全统计，从1927年3月到1928年上半年，共产党和革命群众被杀害的达31万多人，其中共产党人2．6万多人。许多党的著名活动家如陈延年和陈乔年（均为陈独秀之子）、赵世炎、罗亦农、向警予、夏明翰、郭亮等相继牺牲在敌人屠刀下。陈独秀右倾投降主义路线，使党蒙受了重大损失。1927年8月7日，中共中央在湖北汉口秘密召开紧急会议，旗帜鲜明地清算了大革命后期以陈独秀为代表的右倾机会主义错误，选出以瞿秋白为首的新的中央临时政治局。
大革命失败后，陈独秀情绪陷入低潮。他自感大革命失败他要担当重要责任，时时处于苦闷、悲伤之中。但他又不服共产国际和中共中央对他的态度，脑子里还接受不了被撤换职务的现实。中央派人劝他去苏联“讨论中国革命问题”，被他冷冷地拒绝了，请他参加在莫斯科召开的中共“六大”他又不去，“六大”后的党中央告诉他，共产国际要他去莫斯科做东方部长的职务，他初已应允，但后又反悔。此后，党多次安排他的工作，他总是找借口推掉了。为了打发日子，有时，他在家写点方块文章，作点拼音文字方案的研究，不问政治，专心过“平民”生活。在此期间陈独秀也曾一度进行过分裂党的活动，由于追随者极少。党中央对陈独秀等人的活动密切注意，并多次提出警告。但中央每对陈独秀提出一次批评，陈独秀就以更激烈的方式对抗。中央对陈独秀的错误忍无可忍，政治局在1929年11月15日通过了《关于开除陈独秀党籍并批准江苏省委开除彭述之、汪泽楷、马玉夫、蔡振德四人决议案》。1929年的陈独秀是被中共中央开除出党，同时也是他自绝于党，自绝于中国革命。
陈独秀被开除后，立即发表《告全党同志书》，说“毫不隐讳地站在托洛茨基同志所领导的国际反对派旗帜之下”，“坚持的不调和的不中途妥协的和国际及中共中央的机会主义奋斗到底。”陈独秀决定自行组织“中国共产党左派反对派”，选举了常务委员会，陈独秀自任总书记。但是，陈独秀的托派，在中国并未成多大气候。首先，这个组织的理论荒谬，路线错误，响应者极少。另外，虽然托派组织为共产党不齿，但国民党政权却认为它是共产党的一个支派，一直加以打击，托派重要头目屡遭逮捕，陈独秀本人后来也难逃一厄，托派一蹶不振。
值得一书的是，陈独秀在1932年10月被国民党反动派逮捕后的表现。由于托派中央党委谢德盘叛变告密，陈独秀在上海家中被捕，国民党对此欣喜若狂，但不久就搞清楚陈独秀已被中共开除，同中共中央多年没有组织联系。陈独秀被捕后，对险恶环境泰然处之，在从上海押到南京的火车上一路酣声如雷，视死如归。在监狱中，正气凛然，连看守对他都敬佩几分。何应钦找到他题字，他写“三军可夺帅也，匹夫不可夺志也”，既表述自己心迹，又对何应钦这个军人抗日是很好的敬勉。1933年3月底，国民党江苏高等法院以“危害民国案”名义正式向陈独秀提出起诉。陈独秀在《辩诉状》中称，“我一生言论，无不光明磊落，无不可公告国人。我无罪！如果有罪，那就是罪在拥护中国民族利益！罪在拥护大多数劳苦人民！罪在得罪了国民党之缘故。我只有为民族、为民众忍受一切牺牲，以待天下后世之评判！”4月26日，江苏高等法院“以文字为叛国之宣传”为罪名，叛处陈独秀有期徒刑13年，剥夺公民权15年。尽管如此，陈独秀的答辩引起广泛反响，上海沪江大学和苏州东吴大学还专门把他的答辩状和律师章士钊的辩护词列入法律系教材。
陈独秀在国民党监狱里，一直坚贞不屈，表现得很坚强。“七七卢沟桥事变”爆发后不久，日本飞机飞临南京轰炸，陈独秀所在监狱被炸弹击中，他躲在桌下才幸免于难。因时局紧张，国民党要求陈独秀写一个“悔过书”，即可放他出狱，遭陈独秀断然拒绝；无条件释放陈出狱后，蒋介石又拉拢他，要他“组织一个新共产党”，并以10万元经费和国民党参政会五个名额作诱饵，陈独秀也毫不为所动；后蒋介石又想让陈独秀出任国民党政府劳动部长，被陈独秀斥为“异想天开”。陈独秀的这些举动，表现了他很高的个人气节。
陈独秀拒绝了国民党的拉拢，却主动向中共中央派驻南京等地代表联系。表示“愿意重新回党工作”。中央认为，陈独秀在党内外有很大影响，若能重新回到党内工作，是一件好事。但就在这时，刚回国后不久的王明、康生等人，在公开场合谈陈独秀是托派，斯大林是反托洛茨基的；又说陈独秀是日本侦察机关的特务等等。他们无中生有的论调，连国民党地区的一些知识分子都看不惯，不少人起来为陈独秀打抱不平。性格倔强的陈独秀自然受不了这种委屈，从此永远地离开了同党的联系。
1942年5月27日，陈独秀在四川江津县于穷途潦倒中去世。