在南北战争进行期间，林肯的声望越来越高，1864年11月，他第二次当选为美国总统。当选后，他以极大的努力要求参众两院通过宪法第13条修正案——宣布蓄奴非法。这项历史性的宪法修正案于当年终于获得通过。
南方的种植园主们恨透了林肯，他们千方百计想报复林肯。有一个名叫约翰·布斯的演员，是一个同情奴隶制度的家伙，他把奴隶制度说成是“上帝赐给一个他所宠爱的国家的最大福利”。内战期间，他曾协助走私商人把硅宁和其他药品运往南方去。1865年初，布斯和他的四个同伙策划劫夺林肯作为人质，然后与政府交涉，用林肯来交换北方监狱中的南方同盟的俘虏。由于没有找到下手的机会，这个阴谋流产了。1865年3月林肯第二任期总统就职的那天，布斯就站在离国会山台阶上的总统仅有几步之遥的地方，事后他一直自责自己当时竟然没有带上一把枪。
1865年4月14日这天中午，布斯去华盛顿福特剧院取信件，偶尔听见剧院经理说，总统今天要来这里观看晚场节目《我们的美国表兄》，这部戏当时在大西洋两岸很受欢迎。布斯听了心头一阵狂喜，立即召集他的死党分派任务，刺杀林肯的任务由布斯本人承担起来。
4月14日这天是南方军队投降后的第5天，渡过重重危机的林肯高度紧张的神经一下子松弛下来，兴致颇高地来到福特剧院看戏。他坐在装有软垫的椅子上，林肯的夫人坐在旁边一个藤木坐垫的椅子上，美国陆军少校亨利·拉夫邦尼和他的未婚妻也坐在一旁。
晚上10点钟，布斯悄悄地溜进了总统的包厢。本来这个包厢是有锁的，但锁在几天前就坏了，也没有人报告此事。由于布斯是个演员，所以总统的警卫人员都没有为难他。警察约翰·派克本来应该是守在大厅通往包厢的必经之路上，但是他对看戏毫无兴趣，就躲到另一个房间里喝酒去了。
布斯进入总统包厢后，把枪瞄准了林肯的左耳和背脊之间，一共打了8枪，林肯被击中6次，其中5次击中要害。然而现场的1675名观众只有很少人听见了枪声，因为布斯选择在戏剧进入高潮时开枪，演员和观众的笑声把枪声掩盖住了。开完枪后，布斯从包厢里跳到舞台上，又向乔治·华盛顿的画像开了一枪，全场观众都惊呆了，竟然没有一个人追上去。
林肯被刺后，当时并没有死，但是已经奄奄一息，人们把他抬到剧院对面一间稍微宽敞点的屋子里。第二天早晨7时20分，林肯在医院里去世，时年56岁。他是美国历史上第一位遇刺的总统。林肯去世后，他的遗体在14个城市里供群众凭吊了两个多星期，最后被安葬在普林斯菲尔德地区山清水秀的橡树岭公墓。