1925年4月，贺龙任澧州镇守使。7月上旬的一天，在周逸群陪同下，周恩来在鲍公馆专程拜会贺龙。经周逸群引见，周恩来向贺龙分析了当时的政局，深入浅出地讲述共产党的主张，并征求贺龙对蒋介石、汪精卫叛变革命的看法。贺龙听后顿觉打开了自己的思想出口，使他透过黑暗看到了光明。他当即表示：“我听共产党的话，只有共产党才能救中国，只有马列主义才是救国救民的真理，我决心同蒋介石、汪精卫拼到底!”
这次会面，开始了贺龙与周恩来个人之间的深厚友谊，使贺龙在许多的探求中找到了归宿，也使我党在白色恐怖之中，找到了贺龙这支可以依靠的武装力量。从此，贺龙同共产党同呼吸，共命运，为武装起义竭尽了全力。
7月15日前几天，贺龙以“东征讨蒋”为名义，将二十军部队拉出武汉，先后在鄂城、大冶、石灰窑一线集结。汪精卫公开叛变革命后，贺龙在大冶召开了连以上军官训话会，决定带领二十军跟着共产党走。
7月23日，贺龙率部进入九江，受到当地军民的热烈欢迎，也经受了右派将领的百般拉拢。下榻九江大饭店后，朱培德一伙设宴款待，意在邀其赴庐山开会。贺龙派参谋长应酬，决不上当。当晚，中共中央政治局委员、武汉政府农民部长谭平山介绍各省市赴浔代表在九江饭店拜会贺龙，贺龙十分欣喜，热情交谈，他完全拥护党组织南昌起义的决定，并同二十军高级军官打了招呼，一切听共产党的指挥。
第二天，第四军参谋长叶剑英得知张发奎在庐山召集军事会议，意欲将贺、叶部队集结德安，从而解除他们的兵权的消息后，专程到九江邀请贺龙、叶挺等人在甘棠湖商量部队行动。贺龙表示不去庐山开会，部队不到德安，而开往南昌。经商定，叶挺部24日开动。二十军随后于25日开动。
7月26日，贺龙进抵南昌后，军部设在子固路中华圣公会内。当时，谭平山、恽代英等许多党的重要骨干随同驻扎这里。贺龙与他们关系融洽，几乎无话不谈，无事不商。在南昌，当贺龙发现程潜部队的一个团行动不轨，随即命令所部将其缴械。接着，蔡廷锴部下故意为难二十军，甚至抢走了许多战马，枪伤了士兵，贺龙主张予以制裁，只因有些人态度暧昧，致使后来酿成蔡部叛逃的大祸。
27日，党的前委书记周恩来到达南昌后，当即召开前委会议，研究起义的有关重要事项，决定贺龙任二方面军代总指挥兼二十军军长，叶挺任前敌代总指挥兼十一军军长。次日，周恩来代表前委会会见贺龙，委任他为起义军总指挥兼代二方面军总指挥，并嘱咐有关注意事项，贺龙表示：“我听共产党的命令，党叫我怎么干就怎么干!”
第二天，汪精卫、张发奎等在庐山解除贺龙、叶挺的兵权，形势异常紧张，而张国焘还在九江一天连发两份电报，要等他到南昌后再决定是否起义。而这时，刘伯承已经帮助贺龙拟定了起义计划，可算是万事具备，只欠东风了。
可是，7月30日张国焘来到南昌后，仍然坚持“起义要取得张发奎同意，并一致行动”。这种观点，当即受到周恩来、李立三等前委们的坚决反对。贺龙与张国焘只一面之交，但对他将时间一拖再拖非常反感。贺龙强烈表示：“这次要拉张(发奎)则不必干，若要干则不必拉张。”
31日，情况紧急。当天中午，党的前委和起义军主要将领在二十军召开紧急会议，贺龙列席参加。在周恩来等多数人的坚持下，决定8月1日凌晨2时起义，并以第二方面军代总指挥贺龙的名义发出起义命令，各部队作好起义准备。
当天下午，贺龙召开二十军营以上军官会议，严肃宣布说：“国民党已经叛变了革命，旧的国民党已经死了。我们今天要重新树起革命的旗帜，反对反动的政府，打倒蒋介石!”并且告诫部下说：“我们大家在一块儿都已很久了，我们今天要起义。愿意跟我走的，我们一块儿革命；不愿意跟我走的，可以离开部队。今后，我们要听共产党的领导，绝对服从共产党的命令。”
入夜，贺龙以总指挥的名义，命令起义部队封锁道路，断绝交通，各部进入战斗准备。这时，他们颈系红布带，左臂扎白毛巾，马灯和电筒上贴红十字，口令是：“山河统一。”
8月1日凌晨2时，贺龙与周恩来、叶挺、朱德、刘伯承等领导起义部队，打响了中国武装革命反对武装反革命的第一枪。从此，揭开了中国共产党领导武装斗争历史的序幕。
起义战斗打响后，贺龙、刘伯承在起义军总指挥部里指挥战斗。二十军第一师的两个团围攻旧藩台衙门的敌第五路军总指挥部，守敌是警备团的精锐主力。由于起义军一个姓赵的副营长告密，敌人作了推备。起义战斗打响后，敌人封锁了鼓楼，切断了必经之路。贺龙与刘伯承站在石阶上直接指挥，与敌军隔街相望。师长贺锦斋、团长刘达五率部攀登鼓楼，抢占制高点，以猛烈的火力压制敌人，并且指挥部队穿街入巷，翻墙越脊包抄敌人，将敌人压缩在总部大院，迫使他们缴械投降。
在这同时，二十军教导团和第二师，以及第十一军等部队，迅速包抄了小营盘和大营盘敌军的两个团，敌军措手不及，慌忙抵抗，很快投降。
在城北的牛行火车站，二十军第三团三营与敌军同驻一个方位。起义枪声打响后，营长王炳南率部埋伏在敌人的军营外，继而突然对敌实施包围，敌人也就稀里糊涂地缴了枪。
这次起义，从凌晨2时到6时，战斗胜利结束，敌军1万多人全部被歼，南昌起义取得胜利。
上午9时，谭平山以国民党特别委员会的名义，召开在南昌的中央委员及各省区和海外党部代表联席会议。选举了宋庆龄、周恩来、谭平山、贺龙、邓演达等25人组成的“中国国民党革命委员会”，贺龙与宋庆龄、谭平山、邓演达当选为主席团主席。
当晚7时，起义军参谋团会议在二十军的总指挥部召开。贺龙与周恩来、叶挺、朱德、刘伯承和苏联军事顾问纪功参加，研究南下广东的计划和政治纲领。会上，周逸群代表贺龙发了言。贺龙部队多为湘鄂川黔人，知道两湖农民运动基础好，兵源容易补充，语言也容易交流，南下并非他们的本愿。但因南下广东，是共产国际和中共中央在起义前就决定了的方针，因此贺龙服从党的决定。
8月2日，革命委员会正式任命贺龙为第二方面军代总指挥兼二十军军长，廖乾吾为二十军党代表，周逸群为第二十军第三师师长；叶挺为二方面军前敌代总指挥兼二十一军军长；朱德为第九军副军长；刘伯承为参谋长，吴玉章为革命委员会秘书长。起义军共3军16团又两营，共约两万余人，二十军约占半数。这天，聂荣臻、周士第领导的第二十五师也赶到南昌，加入了起义军的行列。
次日，贺龙以代总指挥的名义发布了《告全体官兵书》。这是声讨蒋介石、汪精卫的檄文，也是此次起义的宣言书，声明“我们此次的革命行动，是实行土地革命、为解决农民问题而斗争”。此时，汪精卫集团通缉贺龙、叶挺，张发奎也调兵进攻南昌，于是党的前委决定，起义军撤出南昌，按原订计划，南进广东。
8月4日，二十军部队以一师一团为前卫先行开拔，其他部队相继出发。5日清晨，贺龙与周恩来等领导人率领起义军和革命委员会全部工作人员离开南昌，冒着烈日酷暑，浩浩荡荡地向南进发。不料，6日抵达抚州后，早已动摇的蔡廷锴率部叛逃，使起义军损失兵力1/4。随之，唐生智安插在二十军的参谋长陈浴新也带700人逃往武汉。
起义军进入广昌前后，由于酷暑行军，长途跋涉，加上内部叛逃，敌人造谣中伤，为此，贺龙决定起义军在临州休整并召开起义军连以上军官训话，痛斥反动派对起义军的污蔑，号召部队振作精神，坚定意志，继续南下。
8月22日，贺龙与叶挺从广昌分途前进后，26日，二十军在壬田与前来堵截的敌钱大钧部遭遇。贺龙挥师猛攻，打败了敌军阻击，赢得了南征途中的首战捷报。接着，以叶挺部为主力，在贺龙、朱德的配合下，又打响了会昌战斗，将敌军驱逐于百里之外。
月底，贺龙在瑞金的一所学校，经周逸群、谭平山介绍加入中国共产党，被编入中央特别小组生活。后来他说：在大革命失败、共产党“背时”的时候，我把脑壳别在裤腰带上，死心踏地跟共产党走!
9月15日，贺龙率领起义部队由江西抵福建长汀、上杭后，党的前委和起义军总指挥部讨论了进入广东的作战计划，即准备在汕头成立新的国民政府，扩大武装力量。贺龙同意起义军以主力取潮州、汕头，并以朱德一部兵力在三河坝监视梅县之敌，再经揭阳出兴宁,由五华取惠州。
9月24日，贺龙率部进占汕头。张太雷代表中共中央前来汕头，传达八七会议精神，主张抛弃国民党旗帜，建立苏维埃，并研究了起义部队的行动。
这时，广东钱大钧、黄绍竑等敌军，在敌军3个师的增援下，又在揭阳、潮州、三河坝三个地区摆开战场，形势对起义军十分不利。9月28日，贺龙、叶挺分别率领所部向揭阳进军途中，在汤坑遭到三倍于我的敌军阻截。贺、叶分头率部向敌轮番进攻，相持两天两夜，未能突破敌军包围。9月30日，由于起义军伤亡很大，不得不撤出战斗，向海陆丰转移。当天，已经胜利占领潮州的二十军周逸群第三师部队，在抵御黄绍竑的两个师的进攻中，因敌我兵力悬殊，致使潮州失守。接着，汕头被迫放弃。朱德、周士第指挥的部队，在三河坝坚持两天两夜后，也撤出阵地。至此，起义军在潮州和汕头失败。
在形势极其恶化的情况下，10月3日下午，周恩来在普宁流沙召开前委和军政负责人紧急会议，传达中央决定精神，宣布今后还要打红旗，继续战斗。并且决定，武装人员突围去海陆丰，其他高级军政人员离开部队，分散转移。会上，贺龙痛心地表示，决不甘心，一定要卷土重来。
会议刚完，敌人迎面扑来。贺龙、叶挺分率余部反击敌人，掩护前委和革命委员会安全转移，尔后，在彭湃夫妇的引导下，与刘伯承、吴玉章、林伯渠等经神泉港转移到香港。