正当革命顺利发展之时，天京城发生令人痛心的内讧，东王杨秀清、北王韦昌辉相继被杀，翼王石达开也负气出走。翼王是李秀成的直接领导，翼王出走时要求李秀成同行。李秀成对石达开的文韬武略十分佩服，但是他顾全大局，不同意出走。
太平天国接踵而来的事变，使太平军在各个战场上停止了进攻，轻取守势，从而使清军获得了喘息的机会，并调集兵力，对太平军进行反扑。
在湖北战场，太平军于1856年12月19日放弃武汉，不久，所占沿江各州县也随之全部丧失。清军夹江东下，直逼江西九江城下。在江西战场，1857年9月，瑞州（今高安）失守。1858年1月，临江失守。5月，九江又陷。9月，吉安失守。至此，江西全省陷入清军之手。
在天京周围，1857年6月，清军陷溧水。7月，陷句容。12月，太平军弃守镇江、瓜洲。1858年年初，清军复建江南、江北大营，掘壕筑垒，加紧围困天京。
在安徽战场，情况有所不同。天京事变之后，除皖南各州县迅速被清军攻占外，安庆及其周围地区，基本上仍在太平军控制之下。这一带的军事形势之所以没有迅速恶化，是与李秀成、陈玉成等一批年轻将领的英勇奋战分不开的。
天京内讧前后，李秀成正驻营于江苏句容丁角村。这时，皖北重要据点三河镇被清军围困，守将蓝成春具文到京告急。李秀成奉调带领所部人马离句容前去救援。可是，当行至安徽无为州，就得到三河、庐江已先后于9月16日、18日失守的消息，李秀成便率部进入桐城。
桐城自1853年11月攻占后，一直由太平军据守。李秀成率队送援之前，庐州、舒城、六安、巢县、无为已被攻占，现三河、庐江又失，桐城形势更加危急。从1856年10月21日起，李秀成所部六七千人，接连抗击提督秦定三所率清军的进攻，胜败互见。30日一战失利，几个部将被俘杀。11月13日一战，阵毙游击江忠信。12月2日，夜袭总兵郑魁士营，又软副将萧同福。这时，清军倾全力争桐城。李秀成所部仅六七千人，困守孤城，面对众多的敌人，深感势孤力单，于是他想到了陈玉成。此时陈玉成正在皖南进攻宁国，李秀成“命使持文前往宁国，求救于陈玉成。当即准请……移军来救桐邑之困。兵由枞阳渡江齐集，我亲自轻骑赶赴枞阳，绘成进攻图式，与成天豫（陈玉成）细详”。这时，敌人正面防御较严，如正面力攻，难操胜算，于是双方商定了解救桐城之围的计策，由李秀成即回桐城坚守，而由陈玉成率部下攻，拊敌军之背，然后内外夹击，以解城围。1857年1月，陈玉成部占无为州，下仓头、运漕，会合白天京西来的迓天侯陈仕章等，大败总兵和隆武于东关并占领巢县。然后折而向西，31日占领庐江，经大关进至桐城北乡界河、新店、吕亭，抄敌后路，断敌粮道。2月24日，陈玉成率军由外向内，李秀成率军由内攻出，夹击清军，大败提督秦定三、总兵郑魁士等于桐城之郊，并进占舒城，斩总兵郝光甲。3月3日，占领六安。这一带人民纷纷参军，达数万人。此后，李秀成、陈玉成开始分军。陈玉成率部占正阳关，攻寿州（今寿县）未下，然后领兵入湖北，在广济童司牌一战失利后，退守太湖、潜山。李秀成则向三河，联络张乐行部捻军。行至半路，张乐行已派龚德树、苏天福来迎。两支起义军胜利会师，当即计破霍邱，交捻军作根据地。自此之后，捻军接受太平天国领导，长期与太平军联合作战，成了太平天国北部的坚固屏障。这对当时严重恶化的太平天国军事形势，显得尤为重要。
李秀成自受命援三河后，进据桐城，艰苦奋战，后联合陈玉成部，内外配合，不但迅速攻破了桐城围敌，并乘胜追击，连占舒城、六安、霍邱，扩大了地盘，建立了与张乐行部捻军巩固的同盟关系。这是李秀成单独执行任务后的第一个战绩，也是李秀成、陈玉成两支部队第一次成功的合作，标志着他在军事上、政治上趋于成熟。
这时，天京周围的军事形势又趋紧张。自攻破江南大营、向荣死去之后，清廷即于1856年9月任命和春为钦差大臣，从安徽庐州驰赴江苏丹阳，督办江南军务。1857年7月，清军攻陷句容，再围镇江。同年冬，镇江城内绝粮，洪秀全命令李秀成率军下救。11月7日，李秀成率部数万（内有捻军李昭寿、张乐行部）自六安进至庐州二十里铺。23日，出昭关，逼和州，准备下救镇江。29日，占和州。12月11日，进至江苏高资，与提督张国梁相持。
这时，镇江城内粮食已尽，豆麦等物已吃完，开始杀马、杀驴子吃，并以野菜、芦根充饥。瓜洲、镇江的太平军，开始向高资集中，做好了突围的准备，只等外援一到，就里外会合，突出重围。1857年12月27日，吴如孝等放弃镇江，在李秀成部接应下，突出重围，回归天京。同日，瓜洲守将谢锦章也弃守瓜洲。1857年年底，天王封陈玉成为前军主将，李秀成为后军主将，主持军务，陈、李成为太平天国后期两根顶天支柱。此后陈玉成主要在上游作战，李秀成则活动于天京周围及江浙一带，在东南富庶地区建立根据地，支持和拱卫天京。
李秀成率部自镇江救出吴如孝等守军回到天京之后，受到全朝的赞赏和洪秀全的重用。可是，这时的军事形势仍是严峻的。各战场的形势也越来越严重。在此情况下，李秀成出于对全局的关切，深深感到此时的关键是——京外缺乏调度之将。于是他建议给1854年因湘潭失败而被革职的林绍璋复职，保其为地官又副丞相，负责京内事务，由他自己出京调度天京外围的军务。他一再将这个主意上奏洪秀全，都被拒绝。无奈，他到天王府门口去击鼓鸣钟，强行奏闻。按照太平天国的制度，各机关都设有登闻鼓，凡有要事或冤屈，都可到门口击鼓鸣钟，主管长官听到后就立刻出来受理。洪秀全听到鼓声，就立即坐殿，李秀成将出京的理由从头一一奏明。洪秀全听了之后，同意李秀成出京。
李秀成获准出京之后，将京中之事交与蒙得恩、林绍璋、李春发掌管，辞别洪秀全，由南门一日一夜赶到芜湖，与其堂弟李世贤商定，“一人敌南岸，一人敌北岸”。1858年4月，李秀成带5000余精兵，由芜湖东梁山渡江，到含山集合。5月4日，破含山城西20里之昭关，下和州（今安徽和县）。10日，占全椒。11日，占领滁州。13日，占领来安。李秀成此次军事行动，是绕攻江北大营外围，以分其兵势。21日，清军帮办江北军务侍郎翁同书率部来攻，太平军迎战不利，放弃来安，退回滁州。
不久，李秀成将滁州交由部将李昭寿镇守。李昭寿是河南固始人，1853年在家乡结捻起义，1854年率部投降清道员何桂珍，次年在英山杀何桂珍，投降太平军，隶李秀成部下，是个反复无常的人。李秀成将滁州交李昭寿后，于6月初经全椒到达江浦大刘村安营扎寨，厉兵秣马，准备进攻江北大营。6月5日，江北大营即派清军来攻，首战小胜；次日，清军大队来攻，太平军失利，营垒全部被毁，损失官兵千余人。部队转移到江浦汤泉，李秀成回到了全椒。
李秀成经大刘村之败后，偏处全椒，兵力受到了进一步的削弱，深感要攻破江北大营，单靠自身的兵力是不够的。于是他通知各镇守将，到枞阳会商对策。会议约于7月下旬至8月初召开，各路将领都依约而来，陈玉成也不约而至参加了会议。会议商定了进攻江北大营，以解天京之围的作战方略，“各誓一心，订约会战”。后来这两支太平军主力之间互相合作，取得了二破江北大营的重大胜利。
1858年9月，都兴阿、李续宾即率领大军自湖北入皖，22日攻占太湖，随后即分兵两路，大举进攻。南路由都兴阿率副都统多隆阿和总兵鲍超所部，在水师配合下，进逼安庆；北路由李续宾督率所部，直指庐州。这时，前军主将陈玉成刚刚攻破江苏六合，得报之后，立即扯兵上救；同时启奏天王洪秀全，调后军主将李秀成率部同往。
陈玉成率部先行，于11月7日抵达三河镇西南30里的金牛镇。李秀成率部随后而来，于11月14日驻扎在三河镇东南25里之白石山一带。两支太平军主力号称10万大军，连营数十里，并切断了李续宾军的退路。15日深夜，李续宾派出7个营的兵力，分左、中、右三路袭击金牛镇。16日黎明，其先头部队一度攻入陈玉成的防地，这时大雾弥漫，咫尺莫辨，鼓角相闻，敌我难分，陈玉成部乘势从四面八方掩杀过来，把敌军围困在烟筒（墩）岗一带。这时，李秀成率军助战，李续宾大败，自缢而死。是役一举歼灭湘军精锐6000人。
湘军的惨败，令曾国藩“哀恸填膺，减食数日”；胡林翼在家治丧，听到后当即晕倒在地。
太平军之所以取得全歼李续宾部的胜利，主要由于决策正确果断，兵力集中，战术灵活，指挥无误。当湘军进抵舒城、三河时，陈玉成果断决定兼程回援，并奏调李秀成部同往，形成了兵力对比上的绝对优势。在对敌发起进攻时，太平军采取正面迎战与伏击、抄袭相结合的战法，各部之间又能密切协同，主动配合，迅速分割包围敌人，打得湘军前后左右不能相救，以速决的方式达成战役目的。
通过三河镇大捷，太平军粉碎了湘军东犯的企图，保卫了皖中根据地，对鼓舞士气、稳定江北战局、保证天京安全和物资供应，都具有重大的战略意义。