吴三桂对李自成等所领导的农民起义军有着刻骨的仇恨。李自成离京西走，多尔衮令吴三桂与阿济格多泽日夜兼程，尾追不放。
农民军出京时，用骡马载驮大量物资，行军速度缓慢，才出城30里，他们的殿后部队就被吴三桂追上。农民军回避交战，丢弃金银财物和无数妇女，都被吴军夺走。农民军丢弃的仅是很小一部分，携带过多的财宝已成为他们的巨大负担，每天行军不过数十里，吴军从后边穷追不舍。农民军不得不继续抛弃大量金银财物和辎重物资，减轻负担，轻装快速撤退。从永定河至固安百里，所弃“衣甲盈路”，都被吴军收去。
李自成率部离京经畿南地区，计划走陕西，奔向西安。但他处境日益艰难：后边有吴三桂与清兵的追击；前边有已降农民军的原明朝官员与地方的地主武装纷纷倒戈，拦截农民军撤退。农民军被迫前防后堵，两面作战，伤亡、溃散、逃跑，使农民军大量减员，实力不断遭到消耗。
五月一日上午，李自成及其将士才到达北京南120余里的涿州。在这里，原明官员冯铨等人纠集地主武装，占据涿州，阻击农民军。李自成大怒，挥军攻城，激战达半日，城未攻下，农民军却是“尸横遍野”。李自成无奈，被迫弃而不攻，继续向南撤去。这一战误了时间，使清军、吴军迅速赶了上来。
二日，农民军退至保定。由于仓皇撤离北京，连日行军，屡遭袭击，广大战士已是口干舌燥，饥肠辘辘，人马皆疲。进保定府时，虽说锣鼓喧天，但队伍不整，骑兵无行列，漫无秩序。农民军没有饭吃，就用宝物向当地百姓换些食物充饥。
吴三桂兵已追到，农民军奋起迎战。已受到饥馁折磨和过度疲惫的农民军经受不住清、吴军的凶猛攻击，又失败了。农民军不能立足，迅速撤离保定。为了赢得撤退时间，延缓清、吴军的追击，农民军把从皇宫内带走的锦、绮等御用织物都缠挂在树上，把重新烧制成的金、银块抛置在路旁，目的是诱使追兵争抢财物，稍缓追击，而农民军加快行军速度，日夜兼行300里，把追兵抛在后头。
吴三桂与清将领自然懂得农民军的意图。对于一向以掠夺财物为目的的清军来说，财宝不能不要，却不容许因取财物而误了时间。他们很快又从后面追了上来。
三日这天，清、吴军追至定州北十里清水铺，已远远望见农民军正在向前赶路。与此同时，负责断后的李自成部将谷大成也发现后面尘土飞扬，渐渐地显露出骑兵飞奔的踪影，知道追兵已到，便勒转马头，传令部众停止前进，排成阵式，等待与追兵交战。不一会儿，吴三桂兵赶到，立即发起攻击。农民军已连日奔波，归心似箭，无意恋战。两军刚开始接战，农民军后阵先乱，谷大成厉声呵斥，对临阵逃缩者即以军法处置，挥刀连斩数人，仍然没有制止住部众的骚动。吴三桂看出对方破绽，驱兵大进，农民军阵势顿时大乱。在混战中，谷大成不幸阵亡。部众见主帅被杀，掉头奔溃，自相蹂践。吴军趁势猛攻，农民军死伤累累。李自成部将左光先率部来救，后继的清兵一涌上阵，举长刀，砍断他的马足，马当即扑倒，左光先从马上跌下来，腿跌断。护卫给他换了一匹坐骑，扶他上马，他痛得连马也不能骑。兵士们就把他扛起来，慌忙退出战场，逃走了。余众都往西北方向逃去。此战，农民军死亡数千余人，追兵夺回被带走的妇女2000余人，还有金、银砖720块，以及骡马、器械不计其数，都成了吴军的战利品。清兵又追杀十四五里，然后收兵返回定州屯驻。
定州的地主武装擒斩大顺政权的州牧董复，把头颅献给吴三桂。吴三桂为他的父亲设灵位，特割下谷大成首级，放在吴襄灵前祭祀，“泣血尽哀”。所获辎重财物都赏赐给他的将士。吴三桂召集溃散的农民军，两三日之内，集万余人，收为自己的部下。吴三桂以喜悦的心情，向摄政王多尔衮报捷。
定州之役，是李自成南撤后遭到的第一次重大挫折。此次战役表明，农民军的士气与战斗力在继续下降，已成惊弓之鸟，使人很难相信他会重新振作起来。吴军、清军士气仍处在最佳状态，战斗力毫不见减。名为清、吴军联合追击，但从战斗实况来看，吴军却是充当了开路先锋和追击的英雄，他一直冲战在前，清军基本上充当了后援的角色。清军乐得让吴军与农民军交战，自己保存实力。
自定州败后，农民军于五月四日退至定州南的真定（河北正定）。
一系列的失败让李自成感到蒙受了奇耻大辱，而将士们也因他的败渐怀二心，产生了不信任的情绪，他们一向崇拜的“闯王”，已失去了往日的光彩。李自成把愤怒都集中到吴三桂一人身上，恨得咬牙切齿。
次日，李自成调集大队兵马，督率诸将，要与吴三桂决一死战。在阵前，李自成厉声高呼：“今日亲决死斗，不求人助，乃为豪杰耳！”他指的是吴三桂不许借助清兵，与他决一胜负，才是真本领。吴三桂根本不予理睬，指挥吴军冲阵，清将固山额真谭泰、准塔，护军统领德尔德赫、哈宁噶等率前锋兵参加战斗。双方纵兵大战，从上午一直激战到傍晚，互有杀伤。忽然，东风大作，黄沙蔽天，农民军阵中旗帜或被刮倒，或被折断。李自成感到难以取胜，担心农民军久战有失，急下令收兵，撤离战场。当他正要回营，一流矢飞来，恰射中他的肋下，从马上跌落下来，护卫及诸将忙把他救起，奋力疾驰还营。清、吴军也已力竭，没有追赶，返回营地休息。
这天，农民军陆续撤出真定。据当时在城外目睹实况的边大绶写道：“自北而南，尘土蔽天，然皆老幼参差，狼狈伶仃，十贼中夹带妇女三四辈，全无纪律。”农民军将携带不方便的辎重都烧毁，轻装疾驰。他们经获鹿、井陉，出固关（今河北省井陉县西南），退入山西境内。
固关居山西与河北之间，为一战略要地，易守难攻。吴军与清军自山海关至固关，长驱数千里，不间断地行军，常常是昼夜兼程，也是形神皆疲。在险关面前，不堪再战，急需休整，吴三桂到此决定班师。
五月十二日，吴三桂与英亲王阿济格等出征将领还京。多尔衮派大学士范文程等出城迎接慰劳。入城后，即谒见多尔衮。
吴三桂在短短的两个多月中，借助清兵的支持，连续击败农民军，夺取了京师，将农民军主力驱逐出河北，巩固了京畿地区，为清朝统一全国取得了牢固的立足之地。吴三桂及其将士的这一功绩，得到了清朝统治者的肯定和高度评价。
李自成进入山西以后，起义军与清朝之间形成了以固关为界的暂时休战形势，利用这一机会，李自成的大顺军采取了一系列措施，对地处前沿的山西地区进行整顿，以加强对敌军的抵抗力量，并准备以之为基地，向清朝控制的地区发动反击。一是在力所能及的范围内对反叛势力进行军事镇压。在李自成由北京西撤时，山西中部的一些县如榆次、太谷、定襄等出现了反叛的势力。李自成派军队将这些反叛势力镇压下去，巩固了阵地；二是迁徙缙绅豪民。缙绅豪民是当时叛乱活动的发起者和社会基础，李自成将他们迁到西安等地，河南等地的缙绅豪民也有被迁徙者；三是部署军队，配备文武官员，加强对重要城市和要塞的防御。在太原城内驻兵马一万，并派兵分守山西各关隘。
七月，起义军经过整饬，开始对清朝发动反攻。但各地的反攻大多都是一些小规模的战斗。
这时，起义军内部产生了严重的矛盾，将军李岩是起义军中的杰出将领。丞相牛金星挑拨李自成与李岩的关系。李岩请兵出河南，牛金星诬陷他阴谋反叛，李自成杀掉了李岩、李牟兄弟。大将刘宗敏及军师宋献策闻讯，痛恨牛金星，声言要杀掉他。起义军内部文武不和，矛盾重重，大大削弱了战斗力。
清军入关后，经过短暂的休整，于六月间开始了向起义军的大举进攻。接连占领山西各地。十月初，攻陷太原。大顺政权在山西的控制区所剩无几。
顺治元年（1644年）年末，清廷命吴三桂随英亲王阿济格西征。自边外趋绥德（今陕西省东北部绥德县），一路攻克延安、鄜州，顺治二年（1645年）正月，进攻西安。李自成以数十万人迎战，吴三桂督军厮杀，大败李自成，斩杀数万人。李自成见西安难以坚守，关中也无法立足，于是决定转战豫、楚。李自成出武关南走，吴三桂等率军追击，自襄阳下武昌。一路上李自成的起义军屡战屡败，无立足之地。在九江，李自成的大顺军与清军再次激战，又大败。九江之战后，清军得战胜之威，锐不可当，而大顺军连遭挫折，士气愈发低落，一战即溃。顺治二年（1645年）五月上旬，李自成率部进入九宫山（在今湖北省通县）遭到地主武装团结袭击，不幸遇难。八月，清军师还。吴三桂因参加围剿李自成的起义军立了大功，被召回京师，特设御宴慰劳，赐朝衣一袭，马二匹，晋爵亲王，命出镇锦州。